Funktionsuntersuchungen des maternalen XB/U-Cadherins im Kontext von Zell- Zell-, Zell-Substratadhäsion und Signalprozessen während der frühen Embryogenese von Xenopus laevis

Abstract

Unter den in Xenopus bekannten Cadherinen kann den maternalen Cadherinen XB/U- und EP/C-Cadherin besondere Bedeutung zugemessen werden. Beide liegen koexprimiert im Embryo vor und stellen die Voraussetzung für die Integrität der Blastula dar. Neben dieser mechanischen Funktion der Zelladhäsion wird eine Cadherinbeteiligung auch vor dem Hintergrund Wnt-abhängiger Signaltransduktion im Kontext der dorsoventralen Spezifizierung des Mesoderms diskutiert. Inwieweit sich bisher gemachte Beobachtungen neben einem Eingriff des Cadherinsystems auf Wnt-abhängige Signaltransduktion allein durch die artifiziell induzierbare Depletion des gemeinsamen Mediators β-Catenin erklären lassen, oder ob cadherinvermittelte Zelladhäsion per se diese Differenzierungsvorgänge mit zu beeinflussen vermag, ist Gegenstand kontroverser Diskussion und sollte in dieser Arbeit näher untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden mehrere extrazellulär deletierte Mutanten des zu diesem Zeitpunkt im Embryo exprimierten XB/U-Cadherins erstellt. Von diesen wurde die Mutante XB/UΔe349, deren extrazelluläre Calciumbindungsdomänen unter Erhalt des Signalpeptids deletiert vorliegen, zur näheren Funktionsuntersuchung des Cadherinsystems herangezogen. Die so verlorengegangene Typspezifität erlaubte im dominant negativen Pancadherinansatz Aussagen über die Funktion beider vorhandener maternalen Cadherine. Mittels Immunfluoreszenz konnte die membranständige Expression Cadherinkonstrukte überexprimierender Zellen der dorsalen Marginalzone histologisch gezeigt werden. Die dorsal marginale Überexpression von XB/UΔe349 in Xenopus-Vierzellstadien resultierte im Schwanzknospenstadium in drei unterscheidbaren Phänotypen. Zwei dieser Phänotypen werden ebenfalls nach Überexpression cytoplasmatisch deletierten XB/U-Cadherins post MBT gefunden und konnten unhabhängig von Signalprozessen daher als rein adhäsiver Effekt auf den Vorgang der konvergenten Extension mit resultierender Fehlwanderung des Mesoderms während der Gastrulation bezogen werden. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein weiterer Phänotyp mit stark reduzierter oder fehlender Achsenausbildung identifiziert werden, der ebenfalls nach β-Catenin antisense Oligidesoxynukleotid Knockout-Experimenten beschrieben und auf eine Depletion von β-Catenin aus dem Wnt-Signalweg zurückgeführt wird. Unterstreichen diese Ergebnisse für sich lediglich die unterschiedliche Funktionalität der verwendeten Cadherinmutante, so konnte in dieser Arbeit anhand von Rescueexperimenten die Bedeutung cadherinvermittelter Zelladhäsion im Sinne des postulierten Community-Effektes für die Ausbildung der Dorsoventralachse des Embryos unterstrichen werden: Selbst eine Erhöhung putativer β-Cateninbindungsstellen führte im Koexpressionsansatz mit dem Wildtypkonstrukt von XB/U-Cadherin offenbar durch Wiederherstellung der Zelladhäsion nicht zu einer Verstärkung, sondern zu einem Rescue der Achsendefizienz. Die Wiederherstellung der Adhäsion konnte dabei histologisch gezeigt werden. Vergleichende Koexpression von XB/UΔe349 mit β-Catenin oder Plakoglobin lassen für Plakoglobin weniger eine Mediatorfunktion des Wnt- Signalweges als vielmehr zelladhäsiver Prozesse vermuten. β-Catenin und Plakoglobin könnten daher hinsichtlich Adhäsions- und Signalfunktion in vivo nicht redundant sein. Anhand von Whole Mount in situ Hybridisierungen von Embryonen nach Überexpression von XB/U-Cadherinkonstrukten wurde der Einfluß auf die Genexpression mesodermaler Marker untersucht. Der beobachtete Effekt auf die phänotypische Ausprägung unter Verlust dorsaler Strukturen konnte auf molekularer Ebene bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, daß die Störung des Cadherinsystems zum Zeitpunkt und am Ort der Spezifizierung dorsalen Mesoderms im Embryo mit einer Störung der für die Regulierung des dorsalen Schicksals essentiellenen Genexpression diffusibler und DNA-bindender Proteine einhergeht. Eine Erklärung durch β-Catenindepletion reicht hier nicht aus. Vielmehr scheint die Integrität des Gewebes für den Empfang und Erhalt des einzelnen Signals eine Rolle zu spielen. Daß cadherinvermittelte Zelladhäsion der dorsalen Marginalzone dabei auch indirekte Auswirkungen auf die Expression ventraler Markergene haben, wurde anhand von Rescueexperimenten mit β-Catenin und BMP-4 bestätigt. Entgegen bereits beschriebener Wnt-abhängiger Regulation der Fibronektinexpression konnte in vivo ein Zusammenhang zwischen Cadherinexpression und der Ausbildung der fibrillären Fibronektinmatrix des Blastocoeldaches nicht festgestellt werden. Im animalen Kappenassay konnte gezeigt werden, daß die Störung des Cadherinsystems mit einer Verminderung activinabhängiger Erkennung des Fibronektin-Synergieepitopes durch Integrinrezeptoren einhergeht. Der Mechanismus ist unklar; die Ergebnisse weisen aber auch hier auf eine Beteilgigung der cadherinbedingten Integrität des Gewebes im Sinne des Community-Effektes hin.

Among the Xenopus cadherins the maternal XB/U- and EP/C-cadherin have extraordinary significance. Both are coexpressed in the embryo and are a prerequisite for the integrity of the blastula. Beside their mechanical function in cell-cell adhesion, cadherins are discussed in terms of Wnt dependent signal transduction in the context of dorsoventral specification of the mesoderm. Wether the influence of the cadherin system on Wnt dependent signal transduction observed as it has beenobserved so far, is simply caused by an artifically induced depletion of the common mediator β-catenin from the Wnt-cascade or is additionally influenced by cadherin mediated cell-cell adhesion in vivo, has been controversely discussed. The constructed extracellularly deleted mutant of XB/U cadherin, XB/UΔe349, lacks all extracellular calcium binding domains, including the disfunction of the HAV domain, but still contains the signal peptide. This mutant was used for functional analysis of maternal cadherins during Xenopus mesoderm specification by dominant negative overexpression of transcripts in a pancadherin manner. The expression of all cadherin constructs in the membrane of overexpressing cells were shown by immunfluorescent staining of histologically sectioned Xenopus dorsal marginal zones. The dorsal marginal overexpression of XB/U-cadherin RNA into Xenopus 4 cell stage embryos lead to three different phenotypes in tadpole stages. Two of those, type I and type II, have previously been identified in embryos overexpressing the cytoplasmically deleted mutant XB/UΔc38 after MBT under the control of the CMV-promoter. It was previously shown that those phenotypes developed due to disturbed adhesion processes affecting convergent extension, leading to a misdirection of mesoderm during the gastrulation process. In the work presented here, an additional phenotype III was observed, with strongly reduced or even lacking axial structures. This phenotype was also reported after b-catenin antisense oligodesoxynucleotid knockout experiments and therefore is thought to be a consequence of depleting b-catenin from the Wnt- signaling pathway. However, although overexpressing different cadherin mutants only underline the diverse functions of their wild type domains, the rescue experiments presented here emphasize the necessity of cadherin mediated cell adhesion for signaling events, leading to dorsoventral axis formation in Xenopus. Coexpression of XB/UΔe349 with XB/UWt not only restored cell adhesion, but also dramatically reduced axis deficiency, although providing additional β-catenin binding sites. Coexpression of XB/UΔe349 with β-catenin or plakoglobin suggest a main function in cell adhesion processes of plakoglobin, rather than being a mediator of the Wnt signaling cascade like its homolog β-catenin. Therefore β-catenin and plakoglobin should not be redundant in the respect of adhesion and signaling functions. The effects of overexpressing cadherin constructs on mesodermal marker gene expression was investigated by whole mount in situ hybridization. The observed loss of dorsal structures was confirmed on the molecular level. It was shown that a disturbance of the cadherin system at the time and place of the dorsal mesoderm specification interferes with gene expression of diffusible and DNA binding proteins, essential for regulating the dorsal fate of the embryo. This can not sufficiently be explained by β-catenin depletion. Rather, the tissue integrity itself seems to play an important role in recieving and maintainig those signals. Rescue experiments using β-catenin and BMP-4 also confirmed an indirect effect of cadherin mediated cell adhesion of the dorsal marginal zone on the expression of ventral marker genes. Contrary to the described Wnt- dependent regulation of fibronectin expression, a connection of cadherin expression and fibronectin matrix assembly could not be shown. In animal cap assays the disturbance of the cadherin system lead to a reduced activin dependent recognition of the fibronectin synergy site by integrin receptors. The underlying mechanism remains unclear. However, the results point to a participation of cadherin dependent tissue integrity and the community effect.