Charakterisierung eines nicht selektiven Kationenkanals in Epithelzellen des Pansens von Schafen: Bedeutung für die Osmoregulation der Pansenflüssigkeit

Abstract

Fütterungsabhängig ergeben sich charakteristische Veränderungen in der Pansenflüssigkeit der Wiederkäuer. Der Anstieg der Konzentration der SCFA und die Absenkung des pH-Wertes und deren mögliche pathologische Auswirkungen auf Transport- und Barrierefunktion des Pansenepithels sind seit vielen Jahren bekannt und intensiv untersucht worden. Die fütterungsabhängigen Veränderungen des osmotischen Druckes verursachen eine Reduzierung der Futteraufnahme, verringerte Speichelproduktion, eine Abnahme der Fermentation und eine Schädigung der Epithelfunktionen. Während die pH-Wert regulierenden Mecha¬nismen vielfältig untersucht worden sind, beschränken sich die Untersuchungen über die den osmotischen Druck beeinflussenden Faktoren weitgehend auf deskriptive Datenerhebung. Es war die Absicht der vorliegenden Arbeit, einen Mechanismus der Osmoregulation der Pansenflüssigkeit näher zu charakterisieren. Es ist seit vielen Jahren bekannt, dass es bei Erhöhung der ruminalen Kaliumkonzentrationen zu einer adäquaten Osmoregulation infolge einer erhöhten Natriumabsorption kommt, die vermutlich durch die Öffnung eines nicht selektiven Kationenkanals in der luminalen Membran des Pansenepithels ermöglicht wird. Dieser einzigartige Mechanismus führt dazu, dass die Summe der Kationen Natrium plus Kalium in der Pansenflüssigkeit weitgehend konstant bleibt. Die durchgeführten Versuche verfolgten daher die Absicht, diesen Kationenkanal mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik näher zu charakterisieren. Verschiedene Studien deuteten zudem darauf hin, dass die Regulation der Natriumresorption in Analogie zur Niere einer komplexen hormonellen Steuerung unterliegt. Die endogene Produktion von Prostaglandinen ist gut dokumentiert. Sichere Erkenntnisse über die Wirkung von Prostaglandinen auf die elektrogene Natriumresorption lagen bislang jedoch nicht vor. Die Untersuchungen mit isolierten Pansenepithelzellen erbrachten folgende Ergebnisse: Die elektrogene Natriumleitfähigkeit ließ sich durch Erhöhung von zytoslischem cAMP in Anwesenheit von physiologischen Mengen an Calcium und Magnesium in der NaCl-Perfusionslösung erhöhen. Dabei stieg der Einwärtsstrom der mit CholinCl gefüllten Zellen von 100 ± 7 % auf 236 ± 26 % (p < 0,001) mit deutlicher Depolarisation von 10 ± 2 mV auf 28 ± 3 mV (p < 0,001, CholinCl ohne cAMP: n = 23; CholinCl + cAMP: n = 19). Die pharmakologische Erhöhung von zytosolischem cAMP durch PGE2 und Forskolin hatte vergleichbare Effekte wie die direkte Applikation von cAMP mit der Pipettenlösung. Theophyllin hatte vermutlich aufgrund der fehlenden Prostaglandinsynthese der isolierten Zellen keinen signifikanten Effekt. Die Stimulation der elektrogenen Natriumleitfähigkeit mit dem hohen Anstieg des Umkehrpotentials fand dabei nur in Anwesenheit von zytosolischem Magnesium statt und kann somit vermutlich nicht allein durch den Abfall der zytosolischen Magnesiumkonzentration durch Stimulation des Na+/Mg2+-Austauschers erklärt werden. Die elektrogene Kationenleitfähigkeit der Membran war unspezifisch. Anhand der Umkehrpotentiale wurde die Leitfähigkeitssequenz K+ > Cs+ > Na+ errechnet, welche einer Eisenmann-Sequenz III oder IV entspricht. Somit dürften die Ionen nur nach Verlust ihrer Hydrathülle den Kanal passieren. Die durch Entfernung divalenter Kationen stimulierbare elektrogene Natrium¬leitfähigkeit war durch Verapamil hemmbar. Dagegen hatte Amilorid keinen Effekt. Durch Erhöhung der extrazellulären Magnesiumkonzentration auf 65 mM konnte kein Nachweis einer Leitfähigkeit für dieses Ion erbracht werden. Eine erhebliche elektrogene Leitfähigkeit für Chlorid wurde ebenfalls nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass die elektrogene Natriumresorption über einen nicht selektiven Kationenkanal ermöglicht wird, dessen Leitfähigkeit durch Prostaglandine gesteigert wird. Dabei wirkt intrazelluläres cAMP offenbar direkt auf den Kanal.

Depending on the diet, characteristic changes appear in the rumen fluid of sheep and cows. The rise in SCFA concentration and the reduction in pH as well as their possible pathological implications have been known for many years and have been intensively studied. The changes induced by the diet cause a reduction of feed intake, a drop in saliva production, a decrease in fermentation and damage to the functions of the epithelium. While the mechanisms regulating pH have been extensively examined, there is only descriptive data concerning the factors that influence osmotic pressure. It was the aim of this study to characterize a mechanism of osmoregulation in the rumen fluid. It has been known for many years that an increase in sodium absorption, which is probably caused by the opening of a non-selective cation channel, causes adequate osmoregulation in reaction to an elevated potassium concentration in the rumen. This unique mechanism is responsible for the fact that the sum of the cations sodium and potassium remains largely constant in the ruminal fluid. Therefore, the experiments performed in this study pursued the aim of a further characterization of this cation channel using the patch clamp technique. Various preceding studies portended that - in analogy to the kidney - the regulation of sodium resorption is subject to a complex hormonal regulation. The endogenous production of prostaglandins is well documented. However, there is no clear data on the effect of prostaglandins on electrogenic sodium resorption so far. The examinations using isolated rumen epithelium cells yielded the following results: The electrogenic sodium conductance could be elevated by elevation of cytosolic cAMP in the presence of physiological amounts of calcium and magnesium. Under these conditions, the inward current of cells filled with choline chloride rose from 100 ± 7 % to 236 ± 26 % (p < 0,001) with a marked depolarization from 10 ± 2 mV to 28 ± 3 mV (p < 0,001) (choline chloride without cAMP: n = 23; choline chloride with cAMP: n = 19). A pharmacological increase of cytosolic cAMP by PGE2 and forskolin had comparable effects to the direct application of cAMP via the pipette solution. Theophylline had no significant effect, probably due to the lack of prostaglandin synthesis of the isolated cells. The stimulation of electrogenic sodium conductance with a marked rise in reversal potential only occurred in the presence of cytosolic magnesium and can therefore presumably not be explained fully by the decrease of the cytosolic magnesium concentration induced by the stimulation of the Na+/Mg2+-exchanger. The electrogenic cation conductance of the membrane was unspecific. The conductance sequence of K+ > Cs+ > Na+ was calculated from the reversal potentials, and corresponds to an Eisenmann-sequence III or IV. Thus, ions probably permeate the channel only after losing their hydration shell. The electrogenic sodium conductance could be stimulated by removal of divalent cations and blocked by verapamil. In contrast, amiloride had no effect. Elevation of extracellular magnesium concentration to 65 mM provided no evidence for a conductance of this ion. A substantial electrogenic conductance for chloride was also demonstrated. These results demonstrate that sodium resorption is facilitated by a non selective cation channel, the conductance of which is increased by prostaglandins. Apparently, cAMP interacts directly with the channel.