Mapping urinary chemokines in human Lupus nephritis: potentially redundant pathways recruit CD4+ and CD8+ T cells and macrophages

Abstract

Introduction: Renal infiltration of inflammatory cells contributes to the pathogenesis of Lupus nephritis (LN), one of the most severe complications of Systemic Lupus Erythematosus (SLE). Current knowledge on the chemotactic recruitment mechanisms of these leukocytes relies mainly on findings in rodent models, but the published results are in part contradictory and are probably not representative of the human disease. Simultaneously, many human studies focus on urinary chemokines as LN biomarkers, while omitting the pathophysiological aspect. Methods: We assess various chemokine pathways in human LN by a new, bilateral approach: A broad spectrum of 17 urinary and serum chemokine concentrations were measured by multiplex assays in 25 patients with acute LN and in 78 other SLE patients. Based on the results of this screening, a panel of 8 corresponding chemokine receptors was measured on urinary and blood leukocytes (CD4+, regulatory and CD8+ T cells and CD14+ macrophages) in ten acute LN patients. Results: Nine urinary chemokines were significantly elevated in LN patients and correlated with renal disease activity and urinary cell counts. However, the concentrations displayed considerable interindividual heterogeneity. Among the elevated urinary chemokines was a group of macrophage chemoattractant proteins (MCP), comprised of CCL2 (MCP-1, p<0.0001), CCL7 (MCP-3, p=0.0106) and CCL8 (MCP-2, p<0.0001), CX3CL1 (fractalkine, p<0.0001), as well as a large group of T cell associated chemokines: CCL3 (MIP-1alpha, p<0.0001) and CCL5 (RANTES, p=0.0291), ligands for receptors CCR1 and CCR5; CXCR3 ligands CXCL9 (MIG, p=0.0003) and CXCL10 (IP-10, p<0.0001) and CXCR6-ligand CXCL16 (SR-PSOX, p<0.0001). The assessed urinary chemokines showed varying potential as biomarkers for acute LN, with best results for CXCL16 (Area under the Receiver-Operating-Characteristic- curve (AUROC) = 0.9035) and CXCL10 (AUROC = 0.8868). Both urinary T cell subsets had increased chemokine receptor expression compared to peripheral blood for CCR1 (p=0.0039) and CCR5 (p=0.0039), while urinary CD4+ T cells also expressed CCR6 (p=0.0195), CXCR3 (p=0.0028) and CXCR6 (p=0.0117) more frequently. Urinary regulatory T cells showed similar CCR expression and urinary CD14+ macrophages were enriched for CCR5 expressing cells. A significant correlation of CXCR3+CD4+ T cell counts and the urinary CXCL10 concentration was found (r=0.8667, p=0.0045). Conclusion: The cell specific recruitment pattern seems to be varied for CD4+ T cell subsets, while CD8+ T cells and CD14+ macrophages rely on a limited receptor range. However, urinary chemokine abundance in active LN is individually variable in our cohort and does not offer a singular chemokine usable as universal biomarker or potential treatment target.

Einleitung: Die Lupusnephritis (LN) ist eine der schwerwiegendsten Komplikationen des Systemischen Lupus Erythematodes (SLE). Renal infiltrierende Immunzellen spielen wahrscheinlich eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der LN; die Zellrekrutierung in die entzündeten Nieren ist jedoch unzureichend untersucht. Der aktuelle Wissensstand basiert überwiegend auf Daten aus Tiermodellen, welche die Verhältnisse in der humanen Erkrankung wahrscheinlich nur unzureichend abbilden und teils zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt haben. Gleichzeitig finden sich viele Studien zur humanen LN, welche Chemokine im Urin als Biomarker untersuchen, ohne die pathophysiologischen Aspekte zu beleuchten. Methodik: Mit einem neuen, zweiseitigen Versuchsansatz haben wir daher den Einfluss von Chemokinen in der humanen LN untersucht: Im ersten Schritt wurde mittels Multiplex-Assays ein breites Spektrum von insgesamt 17 Chemokinen im Urin und Serum von 25 Patienten mit akuter LN und 78 weiteren SLE Patienten untersucht. Anhand der Ergebnisse erfolgte die Auswahl von acht komplementären Chemokinrezeptoren, welche mittels Durchflusszytometrie des Urins und Blutes von zehn aktiven LN- Patienten auf CD4+, regulatorischen und CD8+ T-Zellsubsets sowie CD14+ Makrophagen detektiert wurden. Ergebnisse: Neun der 17 untersuchten Chemokine zeigten eine signifikant höhere Urinkonzentration in aktiven LN-Patienten als in anderen SLE-Patienten. Die Konzentration der Chemokine korrelierte mit der Krankheitsaktivität und der Anzahl an detektierten Urinzellen. Die erhöhten Konzentrationen zeichneten sich durch eine deutliche interindividuelle Variabilität aus. Die angereicherten Urin-Chemokine bestanden aus den Makrophagen-assoziierten CCL2 (MCP-1, p<0.0001), CCL7 (MCP-3, p=0.0106) und CCL8 (MCP-2, p<0.0001), CX3CL1 (fractalkine, p<0.0001), sowie aus einer größeren Gruppe von T-Zell-assoziierten Chemokinen: CCL3 (MIP-1alpha, p<0.0001) und CCL5 (RANTES, p=0.0291), beides Liganden für CCR1 und CCR5; CXCR3-Liganden CXCL9 (MIG, p=0.0003) und CXCL10 (IP-10, p<0.0001) und CXCR6-Ligand CXCL16 (SR-PSOX, p<0.0001). Das Potential als Biomarker für die akute LN variierte zwischen den Chemokinen. Die besten Ergebnisse erreichten CXCL16 (Area under the Receiver-Operating-Characteristic-curve (AUROC) = 0.9035) und CXCL10 (AUROC = 0.8868). Verglichen mit aus dem Blut gewonnenen Zellen zeigten beide T-Zellsubsets im Urin eine erhöhte Fraktion von CCR1+ (p=0.0039) und CCR5+ (p=0.0039) Zellen. CD4+ T-Zellen exprimierten jedoch im Urin ebenfalls häufiger CCR6 (p=0.0195), CXCR3 (p=0.0028) und CXCR6 (p=0.0117) als im Blut. Regulatorische T-Zellen zeigten eine ähnliche Expression; CD14+ Makrophagen exprimierten im Urin häufiger CCR5. Zudem zeigte sich eine signifikante Korrelation zwischen CXCR3+CD4+ T-Zell-Anzahl im Urin und der CXCL10-Urinkonzentration (r=0.8667, p=0.0045). Schlussfolgerung: Die renale Rekrutierung scheint bei CD4+ T-Zellsubsets deutlich variantenreicher zu sein als bei CD8+ T-Zellen und CD14+ Makrophagen. Die hier erstmalig beschriebene individuelle Variabilität der Chemokine legt jedoch nahe, dass entsprechende diagnostische und therapeutische Konzepte auf das Individuum zugeschnitten sein müssen.