Antivirale Wirksamkeit des Fc-gekoppelten CAR-Like-Soluble-Proteins (CLSP-Fc) bei Coxsackie- und Adenovirusinfektionen

Abstract

Coxsackie- und Adenoviren sind als humanpathogene Erreger Verursacher zahlreicher, meist harmlos verlaufender Infektionskrankheiten beim Menschen. Unter gewissen Umständen allerdings kann die lokale Immunabwehr des Wirts überwunden werden und eine lebensbedrohliche Erregerausbreitung mit gravierenden Organmanifestationen folgen. Allen voran das zur Gattung der Enteroviren gehörende Coxsackievirus B3 (CVB3) steht nachweislich sowohl im kausalen Zusammenhang mit akuten und chronischen Myokarditisverläufen als auch der dilatativen Kardiomyopathie (DCM). Auch Adenoviren (Ad) konnte eine Assoziation mit Herzmuskelinfektionen und DCM nachgewiesen werden. Antivirale Therapieansätze, wie sie momentan in der Erprobung sind, bieten vielversprechende Möglichkeiten das zumeist symptomatisch orientierte, klinische Behandlungsrepertoire zu erweitern und damit eine dringend erforderliche, gezielt-antivirale Therapieoption zu liefern. Der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR), welcher in seiner membranständigen Form als wichtiger primärer Virusbindungs- bzw. Internalisierungsfaktor für zahlreiche humanpathogene Adenoviren bzw. Gruppe-B-Coxsackieviren fungiert, besitzt in seiner löslichen (solublen) Form (sCAR) ein ausgeprägt antivirales Wirkpotential. Durch sterische Inhibierung der viralen Rezeptorbindungsstellen und zusätzlich im Falle der Coxsackieviren durch A-Partikelformation kann sCAR als lösliches Rezeptoranalogon (LRA) die Infektiösität der Viruspartikel herabsetzen bzw. gänzlich ausschalten. Ein in entscheidenden Teilen der Sequenz und Struktur dem sCAR ähnelndes, lösliches Protein, das CAR-Like-Soluble-Protein (CLSP), wurde unlängst entdeckt und charakterisiert. Dem scheinbar nur in Mäusen und Ratten vorkommenden CLSP konnte bereits in ersten Experimenten die Bindungsfähigkeit zu Adenoviren und eine daraus resultierende antivirale Wirksamkeit nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde ein neues Fusionsprotein, das Fc-Teil-gekoppelte CAR-Like- Soluble-Protein (CLSP-Fc) konstruiert und in einen Doxycyclin-regulierbaren Plasmidvektor (pAdG12) kloniert. Das antivirale Potential des CLSP-Fc konnte erstmalig im Hinblick auf CVB3- und Adenovirusinfektionen überprüft und vergleichende Daten mit dem bereits etablierten antiviral-wirksamen sCAR-Fc erhoben werden. Hierbei zeigte sich im Rahmen von in vitro-Experimenten eine Zunahme des antiadenoviralen Effekts in Abhängigkeit von der eingesetzten CLSP-Fc-Konzentration. Während unter den verwendeten Proteinhöchstmengen von 1000 ng/ml mit dem CLSP-Fc eine maximale Reduktion der Viruspartikelaufnahme in HeLa-Zellen von ca. 20 % (19,5 % +/- 5,4 %) erreicht wurde, war beim analog eingesetzten sCAR-Fc der inhibitorische Maximaleffekt mit ca. 40 % (40,7 % +/- 7,6 %) deutlich höher. In den zur Testung des anticoxsackieviralen Potentials durchgeführten Plaque-Assays mit HeLa-Zellen zeigte sich, dass selbst bei verhältnismäßig geringen Viruspartikelmengen (0,005/0,001 moi) und maximalen CLSP-Fc-Konzentrationen (3500 ng/ml) für das neuartige Fusionsprotein keine anticoxsackievirale Wirkung nachgewiesen werden konnte. Hingegen führten sCAR- Fc-haltige Zellkulturüberstände in allen Ansätzen zu einer vollständigen Inhibierung der CVB3-Replikation. Trotz ausgeprägter Sequenzhomologie der IgV1-Domäne des CLSP-Fc zur virusbindenden D1-Domäne des CAR/sCAR-Fc scheinen punktuelle Sequenzabweichungen im Bereich bindungsrelevanter Regionen der IgV1-Domäne sowie differente Strukturmerkmale des CLSP-Fc zum originären Rezeptor eine im Vergleich zum sCAR-Fc geringere antiadenovirale Wirkpotenz und fehlende anticoxsackievirale Wirksamkeit zu erklären.

Coxsackie- and adenoviruses cause numerous, for the most part harmless illnesses in humans. However, under certain conditions the local immune defenses of the host can be overwhelmed and a life-threatening increase of the pathogen can occur with grave organ manifestations. Both virus groups are associated with a number of cardiac illnesses, among others. Above all, the coxsackievirus B3 (CVB3), which belongs to the genus of enteroviruses, has been shown to play a causal role not only in acute and chronic myocardial disorders, but also in dilated cardiomyopathy (DCM). Adenoviruses (Ad), as well, have been shown to be associated with cardiac muscle infections and DCM. Current antiviral therapeutic approaches offer attractive opportunities for extending the mainly symptom-oriented clinical treatment repertoire. In its membrane-bound form, the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is an important primary virus binding factor and/or internalization factor for numerous human pathological adenoviruses and group B coxsackieviruses. In its soluble form (sCAR) CAR has a pronounced antiviral potential: by means of steric inhibition of the viral receptor binding sites and - in addition in the case of the coxsackieviruses - by means of A-particle formation, it is able, as a soluble receptor analog to reduce the infectivity of the virus particles or even overcome it completely. Recently, a soluble protein was discovered and characterized which resembles sCAR in decisive regions of its sequence and structure, the CAR-Like-Soluble-Protein (CLSP). CLSP, which apparently is present only in mice and rats, has been shown in first experiments to have a binding capacity for adenoviruses and, as a result, to have an antiviral effectiveness. In the present investigation a new fusion protein was created, the Fc-coupled CAR-Like-Soluble-Protein (CLSP-Fc), and cloned into a doxycycline-regulatable plasmid vector (pAdG12). For the first time the antiviral potential of CLSP-Fc was analyzed with respect to CVB and adenovirus infections, and comparative data obtained for the already established antiviral sCAR-Fc. In vitro experiments showed that there was an increase in the anti-adenoviral effect dependent on the concentration of the CLSP-Fc. Given the highest protein amounts of 1000 ng/ml, with CLSP-Fc a maximum reduction of virus particle uptake in HeLa cells of about 20 % (19.5 % +/- 5.4 %) was achieved, whereas with analogously employed sCAR-Fc the maximum inhibitory effect was clearly higher at about 40 % (40.7 % +/- 7.6 %). In the plaque assays conducted with HeLa cells for testing the anti-coxsackievirus potential it was determined that even with comparatively low concentrations of virus particles (0.005/0.001 moi) and maximal CLSP-Fc concentrations (3500 ng/ml) the new fusion protein showed no anti-coxsackievirus effect. On the other hand, cell culture supernatant containing sCAR-Fc resulted in all approaches in a complete inhibition of CVB3 replication. Despite a pronounced sequence homology of the IgV1 domain of the CLSP-Fc with the virus-binding D1 domain of the CAR/sCAR-Fc, it seems that the observed lack of effectiveness can be explained by local sequence divergences in binding-relevant regions of the IgV1 domain, as well as by different structural properties between the CLSP-Fc and the original receptor. This leads to the conclusion that in all probability, given the comparatively low anti-adenovirus effectivity and the lack of anti-coxsackie virus effectivity, CLSP-Fc in comparison with the established receptor analog sCAR-Fc seems to offer no advantage as a new pharmacological substance.