Molekulare Charakterisierung des ROCK1 Gens von Arabidopsis thaliana

Abstract

Das Gen ROCK1 war in einem genetischen Screen in Arabidopsis thaliana als positiver Regulator der Cytokinindefizienz identifiziert worden. In der vorliegenden Arbeit wurde ROCK1 molekular charakterisiert und die Rolle von ROCK1 bei der Cytokininhomöostase untersucht. Die Untersuchung der ROCK1 Expressionsdomänen durch das Reportergenkonstrukt ROCK1:ROCK1-uidA hat ergeben, dass ROCK1 in Spross und Wurzel vor allem in jungem teilungsaktivem Gewebe exprimiert wird. Die detaillierte Analyse der subzellulären Lokalisation zeigte, dass es sich bei ROCK1 um ein im Endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisierendes Protein handelt. Der Verlust eines C-terminalen Dilysinmotivs führte zur fast vollständigen Lokalisation im Golgi. Der Vergleich des Cytokiningehalts in rock1-1 35S:CKX1 mit 35S:CKX1 Pflanzen ergab, dass dieser im Spross deutlich stärker erhöht war als in der Wurzel. Es ist möglich, dass diese Zunahme die Ursache für die phänotypische Reversion war. rock1 verringerte die CKX Aktivität und supprimierte den Cytokinindefizienzphänotyp bei den Linien 35S:CKX1, 35S:CKX2 und 35S:CKX3, nicht jedoch bei 35S:CKX7-GFP. rock1 hatte nur geringe Auswirkungen auf den Cytokinindefizienzphänotyp von Mutanten mit verringerter Cytokininperzeption oder -synthese. Dies deutet darauf hin, dass ROCK1 den Cytokininstatus primär durch die Verringerung der Aktivität von CKX Enzymen beeinflusst. Der Verlust von ROCK1 im Wildtyphintergrund führte zu einer erhöhten Aktivität des generativen Sprossapikalmeristems, hatte jedoch nur milde Konsequenzen für den vegetativen Phänotyp. Der Gesamtcytokiningehalt der rock1 Pflanzen war erhöht, der Cytokininstatus jedoch nur leicht erhöht und die Cytokininsensitivität unverändert. Sowohl der höhere Anteil an N glukosylierten Cytokininen, die bei exogener Gabe von Cytokinin entstanden, als auch die überproportionale Zunahme der N-glukosylierten Cytokininmetabolite im Gesamtcytokiningehalt lieferten Hinweise darauf, dass die N Glykosylierung von Cytokininen in rock1 Pflanzen die verringerte Deaktivierung durch Abbau kompensieren konnte. Die Überexpression von ROCK1 führte zu einer verfrüht einsetzenden Blattseneszenz und einem geringeren Wurzelwachstum. Der Sprossphänotyp entstand nicht durch einen verringerten Cytokininstatus in Folge einer erhöhten CKX Aktivität und der Cytokininstatus im Spross war unverändert. Die Wurzel zeigte eine erhöhte Cytokininsensitivität, womöglich in Folge einer verringerten Fähigkeit zur Deaktivierung von Cytokininen durch Glykosylierung. Für ROCK1 konnte eine Transportaktivität für UDP-GlcNAc und UDP-GalNAc in Hefemikrosomen nachgewiesen werden. Somit handelt es sich bei ROCK1 um den ersten identifizierten pflanzlichen Transporter für diese Nukleotidzucker. Die Expression eines menschlichen UDP-GlcNAc Transporters im ER von rock1-1 35S:CKX1 Pflanzen führte jedoch zu keiner Komplementation der rock1-1 Mutation. rock1 hatte keinen messbaren Einfluss auf die Proteinabundanz oder N Glykosylierung von myc-CKX1. Die Kreuzung von 35S:CKX1 mit complex glycan less1 ergab, dass die Aktivität von CKX1 unabhängig von hybriden und komplexen N Glykanen ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit Hinweise darauf liefert, dass ROCK1 an einer bislang nicht beschriebenen Form der Proteinglykosylierung mit GlcNAc oder GalNAc im ER beteiligt ist. Das Vorhandensein dieser Modifikation beeinflusst unter anderen die Aktivität von CKX Enzymen. Durch einen genetischen Screen auf Suppressoren der rock1 Mutation konnten allelische Suppressormutationen isoliert und mittels next- generation sequencing ein 2,5 Mb großes Kartierungsintervall definiert werden. Die Identifizierung der ROCK IS OVER (RIO1) Gene wird weitere Hinweise auf die physiologische Funktion von ROCK1 in Pflanzen und die Natur der in dieser Arbeit postulierten Proteinglykosylierung im ER liefern.

The gene ROCK1 was identified in a genetic screen as a positive regulator of cytokinin deficiency in Arabidopsis thaliana. The presented thesis contains the molecular characterization of ROCK1 and the analysis of its role in cytokinin homeostasis. The analysis of ROCK1 expression using the reporter construct ROCK1:ROCK1-uidA revealed ROCK1 expression domains mainly in young mitotically active tissues of root and shoot. A detailed analysis of the subcellular localization showed that ROCK1 is localized in the endoplasmic reticulum (ER). The loss of a C-terminal dilysine motif led to an almost complete re-localization to Golgi. The comparison of cytokinin content of rock1-1 35S:CKX1 and 35S:CKX1 plants showed a stronger increase in shoot than root. It is possible that this increase was the cause for the phenotypic reversion. rock1 decreased the CKX activity and suppressed the cytokinin deficiency phenotype of the lines 35S:CKX1, 35S:CKX2 and 35S:CKX3 but not of 35S:CKX7-GFP. rock1 had only weak effects on the cytokinin deficiency phenotype in mutants with a decreased perception or synthesis of cytokinin. This suggests that ROCK1 influences the cytokinin status primarily by reducing the activity of CKX enzymes. The loss of ROCK1 in wild type background led to a higher activity of the shoot apical meristem, but had only mild effects on the vegetative development. The total cytokinin content was increased in rock1, the cytokinin status only slightly increased and the cytokinin sensitivity unchanged. The increased amount of N glucosylated cytokinins after exogenous cytokinin application as well as a disproportionately high increase of N-glucosylated cytokinin metabolites under normal conditions supported the idea that in rock1 plants cytokinin N glycosylation compensated for the decreased degradation. Overexpression of ROCK1 caused earlier initiation of leaf senescence and decreased root growth. The shoot phenotype was not caused by an increase in CKX activity and decreased cytokinin status, which was unchanged in the shoot. The root displayed increased cytokinin sensitivity, probably due to a decreased ability for deactivating cytokinins by glycosylation. It could be demonstrated that ROCK1 transports UDP-GlcNAc and UDP-GalNAc in the yeast microsomes. Hence, ROCK1 is the first identified plant transporter for these nucleotide sugars. The expression of a human UDP-GlcNAc transporter in the ER of rock1 plants did not complement the rock1 mutation. No influence of rock1 on protein abundancy or N-glycosylation of myc-CKX1 protein was detected. The cross of 35S:CKX1 with complex glycan less1 revealed that CKX1 activity is independent of hybrid and complex N-glycans. In summary, results of this thesis indicate that ROCK1 is involved in a yet unknown type of ER protein glycosylation utilizing GlcNAc or GalNAc. This putative modification influences among others the activity of CKX enzymes. Allelic suppressor mutations of rock1 were identified in a genetic screen and mapped to a 2.5 Mb interval by next-generation sequencing. The identification of the ROCK IS OVER (RIO) genes will provide further insights into the physiologic function of ROCK1 and will help to reveal the nature of the protein glycosylation postulated in this thesis.