Genexpressionsanalysen muriner Knochenmarkstromazellen und ihrer neuronalen Differenzierung

Abstract

Knochenmarkstromazellen (KMSZ) wurden zum ersten Mal in den Siebziger Jahren durch ihre selektive Adhäsion an Kunststoffoberflächen von Zellkulturgefäßen gewonnen und als Kolonie-bildende Fibroblasten ("colony-forming-unit fibroblasts", CFU-F) beschrieben. Schon früh zeigte sich ihre Fähigkeit, in verschiedene mesenchymale Zelltypen wie Osteoblasten, Chondrozyten und Adipozyten zu differenzieren. KMSZ werden deshalb auch als mesenchymale Stammzellen bezeichnet. In den letzten Jahren zeigten verschiedene Publikationen die Differenzierung in vivo oder in vitro in weitere Zelltypen wie Myoblasten, Zellen des Lungenepithels, Herzmuskelzellen und neurale Phänotypen (Astrozyten und Neuron-ähnliche Zellen). Damit differenzieren KMSZ nicht nur in nahe verwandte Zelltypen, sondern sogar in Zellen, die unterschiedlichen Keimblättern zugerechnet werden. Die Fähigkeit von KMSZ, in vitro einen neuronalen Phänotyp zu entwickeln, wurde unter anderem in der Arbeit von Woodbury et al. (2000) gezeigt. Die Ursachen der Differenzierungsfähigkeit von KMSZ sind nicht bekannt. Weiterhin herrschte bis zum Beginn der vorliegenden Studie Unklarheit über den genauen (in vivo) Phänotyp von KMSZ. In der vorliegenden Arbeit sollte durch Genexpressionsanalysen mit Hilfe von cDNS-Mikroarrays ein molekulares Profil muriner KMSZ erstellt und ihre Differenzierung in Zellen mit einem neuronalen Phänotyp in einer Zeitreihenanalyse untersucht werden. Undifferenzierte KMSZ der Maus exprimieren in vitro Gene, die für unterschiedliche Zelltypen wie z.B. neurale Zellen, verschiedene Muskelzelltypen, Zellen des Bindegewebes sowie Gefäß-assoziierte Zellen charakteristisch sind. Literaturvergleiche ergaben eine große molekulare Ähnlichkeit mit Perizyten. Perizyten sind Zellen, die in der Basalmembran kleiner Gefäße lokalisiert sind. Auch morphologisch besteht in vitro eine große Ähnlichkeit zwischen Perizyten und KMSZ. Zur genaueren Untersuchung wurden Kryoschnitte des adulten Knochenmarks mit Antikörpern gegen verschiedene Proteine von in KMSZ exprimierten Genen markiert, u.a. Cadherin 13, Vimentin, Slug und VE-Cadherin. Alle färbten übereinstimmend Gefäß-assoziierte Zellen an und unterstützen damit die Vermutung, daß es sich bei KMSZ um Perizyten des Knochenmarks handelt. Die neuronale Differenzierung der KMSZ wurde zunächst durch Immunfärbungen neuraler Proteine (u.a. Neurofilament-M, Neuronen-spezifische Enolase, Nestin, RC2, GFAP, O4, GalC) validiert. Etwa 85% der kultivierten KMSZ synthetisierten nach zweitägiger Inkubation im Differenzierungsmedium NF-M, keine der kultivierten Zellen Marker für Astrozyten (GFAP) und Oligodendrozyten (O4, GalC). Während der neuronalen Differenzierung muriner KMSZ änderte sich das Expressionsmuster vieler Gene, die für Proteine z.B. des Zytoskeletts, der extrazellulären Matrix sowie Komponenten der Signaltransduktion kodieren. Eine Funktion in der neuronalen Differenzierung wurde für verschiedene der festgestellten Gene bereits beschrieben. Aufgrund der differentiellen Expression des Transkriptionsfaktors Slug, der unter anderem entscheidend für die Epithelial-mesenchymale Transition während der Entstehung von Neuralleistenzellen ist, wurde die Expression weiterer Neuralleisten- spezifischer Gene, Noelin, Twist und Snail, untersucht. Diese sind wie Slug bereits in undifferenzierten KMSZ exprimiert. Auch die Expressionsänderungen der Gene von Sox-8, -9 und -10, Wnt-1 und -3a sowie Pax-3 und -6 im Laufe der Differenzierung deuten auf Ähnlichkeiten der neuronalen Differenzierung adulter KMSZ mit Regulationsmechanismen der frühen neuronalen Entwicklung hin, genauer der Entstehung und Spezifizierung der Neuralleistenzellen. Diese Ähnlichkeiten werfen die Frage auf, ob KMSZ während ihrer neuronalen Differenzierung ein molekulares Programm aktivieren, welches ursprüngliche Entwicklungsschritte der neuronalen Entwicklung rekapituliert, oder ob KMSZ vielleicht selbst von Neuralleistenzellen abstammen. Mit einer möglichen neuroektodermalen Abstammung von KMSZ ließe sich ihr Differenzierungspotential erklären und es ergäben sich völlig neue Perspektiven, sie weiter entwicklungsbiologisch zu untersuchen.

Bone marrow stromal cells (BMSC) were first identified by their adherence to plastic tissue culture dishes and termed "colony forming-unit fibroblasts" (CFU-Fs). These had the ability to differentiate into different mesenchymal cells like osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. For that reason, BMSC are also called mesenchymal stem cells (MSCs). In recent years several publications showed the differentiation of BMSC in vitro or in vivo into myoblasts, epithelial cells, cardiac muscle cells and neural phenotypes, i.e. BMSC differentiate even into cells of different germ layers. The fascinating capacity of BMSC to develop a neuronal phenotype in vitro was for example shown by Woodbury and colleagues (2000). The differentiation of BMSC towards a neuronal phenotype raises the question of the mechanisms underlying these processes. Furthermore, the exact (in vivo) identity of BMSC had not been known in the beginning of this study. Therefore, gene expression analyses of murine BMSC using cDNA-microarrays were performed to establish a molecular profile of these cells and their neuronal differentiation. Undifferentiated BMSC express genes that code for proteins of different cells like neural cells, different muscle cells, mesenchymal cell types and vascular-associated cells. Literature-analyses of the expressed genes showed a high similarity to pericytes. Pericytes are localized in the basement membrane of small vessels like capillaries. Also the morphology of BMSC and pericytes in vitro is very similar. To confirm a vascular-associated phenotype of BMSC in vivo, slices of adult murine bone marrow were marked for proteins that are expressed by BMSC in vitro, e.g. Cadherin 13, Vimentin, Slug and VE-Cadherin. All antibodies stained blood vessel-associated cells and therefore support the proposed pericytic nature of BMSC in vivo. The neuronal differentiation of murine BMSC was validated with several antibodies against neural proteins (e.g. neurofilament-M, neuron-specific enolase, nestin, RC2, GFAP, O4). About 85% of the cells were positive for the neuronal marker NF-M after 2 days of differentiation, none of the cells expressed markers for astrocytes (GFAP) or oligodendrocytes (O4, GalC). The time-course analysis of the neuronal differentiation of murine BMSC with cDNA-microarrays revealed gene expression changes of genes that code for proteins of for example the cytoskeleton, the extracellular matrix or components of signal transduction pathways. Many of those were already correlated to the process of neuronal differentiation. Because of the differentially expressed gene of the transcription factor Slug, that is responsible for epithelial-mesenchymal transition (EMTs) in the development of neural crest cells, the expression of other neural crest- specific genes was analysed (Twist, Snail and Noelin). These genes are also already expressed in undifferentiated BMSC. The differential expression of Sox-8, -9 and -10, Wnt-1 and -3a, as well as Pax-3 and -6 in course of the differentiation reveals similarities of the neuronal differentiation of BMSC with processes of early neural development, i.e. the specification and differentiation of neural crest cells. One explanation for these similarities would be that BMSC activate a transcriptional program that recapitulates early steps of neuronal development. Another possibility, which had to be proven in future, would be that BMSC are descendants of neural crest cells themselves. A neuroectodermal origin of BMSC could also explain their differentiation capacity and would raise a completely new perspective to investigate their developmental biology.