Die EHV-2 bedingte equine Keratokonjunktivitis Evaluierung der Rolle immunologischer Mechanismen sowie viraler und bakterieller Co-Faktoren

Abstract

Eine Beteiligung des Equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2) bei verschiedenen Formen entzündlicher Erkrankungen der Kornea und/oder Konjunktiva des Pferdes ist mehrfach belegt, die genaue Pathogenese der equinen Keratokonjunktivitis ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Im Mittelpunkt der hier vorgelegten Arbeit stand daher die Frage, ob EHV-2-infizierte augenkranke Pferde möglicherweise einen von der Norm abweichenden zellulären Immunstatus aufweisen. Die dabei erzielten Ergebnisse sollten Rückschlüsse auf die Pathogenese der Erkrankung möglicherweise beeinflussende immunsupprimierende Mechanismen des EHV-2 zulassen. Weiterhin sollte überprüft werden, ob andere virale und/oder bakterielle Erreger eine Rolle bei der equinen Keratokonjunktivitis spielen. Schließlich sollten die Studien zum Gewebe- und Zelltropismus des EHV-2/-5 im Auge einen weiteren Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der Erkrankung leisten. Die Untersuchungen zum zellulären Immunstatus wurden vergleichend bei zehn augenkranken und 21 klinisch gesunden Pferden durchgeführt. Aus Blutproben isolierte PBL und Augentupferproben wurden hierfür einerseits mittels EHV-2 spezifischer nested PCR untersucht. Andererseits wurden serologische Untersuchungen durchgeführt und der zelluläre Immunstatus jedes Pferdes mittels Durchflusszytometrie und Differentialblutbildanalyse ermittelt. Bei dieser Studie wurde EHV-2 sowohl bei augenkranken als auch bei klinisch gesunden Pferden aus Blut- und Augentupferproben mittels nPCR bzw. Serologie nachgewiesen, ein signifikanter Zusammenhang zwischen EHV-2 und dem Merkmal augenkrank gelang hingegen mit keiner der genannten Methoden. Beim zellulären Immunstatus war einzig die Anzahl der B-Lymphozyten bei augengesunden EHV-2 positiven Pferden im Vergleich zu augenkranken bzw. -gesunden EHV-2 negativen Pferden signifikant häufiger erniedrigt. Dies könnte ein erstes Indiz dafür sein, dass eine EHV-2 Infektion oder Reaktivierung die BZellzahl messbar reduzieren kann. Aufgrund des geringen Stichprobenumfangs können jedoch erst weiterführende Untersuchungen Aufschluss darüber erbringen, inwieweit diese individuellen Unterschiede im Immunsystem entscheidend Einfluss nehmen auf den Ausbruch einer EHV-2-induzierten Keratokonjunktivitis. Zur Klärung der Frage, ob virale oder bakterielle Erreger als Co-Faktoren bei der EHV-2 bedingten equinen Keratokonjunktivitis beteiligt sind, wurden von einer zweiten Studienpopulation (bestehend aus 68 augenkranken und 32 klinisch gesunden Pferden) entnommene Augentupfer- und Blutproben zunächst auf EHV-2 und anschließend auch auf EHV-5 mittels nPCR untersucht. Stichprobenartig wurden Tupfer von Test- und Kontrolltieren schließlich noch mittels erregerspezifischer PCR auf EAdV-1, Chlamydien und Mykoplasmen untersucht. Die nPCR zum Nachweis von EAdV-1 war zuvor im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit etabliert worden. Signifikante Unterschiede zwischen augenkranken und gesunden Pferden bei der Häufigkeit des Nachweises von EHV-2 aus Tupfer- bzw. Blutproben wurden auch bei dieser Studienpopulation nicht festgestellt. Auch Hinweise auf eine Beteiligung von EAdV-1 oder Chlamydien und Mykoplasmen bei entzündlichen Erkrankungen der Kornea und/oder Konjunktiva des Pferdes ergaben sich nicht. Wahrscheinlich ist hingegen, dass EHV-5 an der Pathogenese der equinen Keratokonjunktivitis beteiligt ist, da im kranken Auge EHV-5-Genom im Vergleich zu EHV-2 häufiger detektiert wurde, wenn auch wiederum nicht signifikant mit dem Merkmal augenkrank korrelierend. Die Studien zum Gewebe- und Zelltropismus wurden an verschiedenen Augengeweben (Konjunktiva, Kornea, Nervus opticus und Retina) sowie Cytobrushtupferproben durchgeführt, die post portem von 14 gesund geschlachteten Pferden entnommen wurden. Der Nachweis von EHV-2 und -5-Genom mittels nPCR gelang hierbei im Cytobrushtupfer sowie im Augengewebe ausschließlich in der Konjunktiva, wenn auch mit einer sehr niedrigen Nachweisrate (Anteil EHV-2 bzw. -5 positiver Tupfer: jeweils 11%; Anteil EHV-2 bzw. -5 positiver Konjunktiven: 7 bzw. 8%). Bei der anschließend exemplarisch am EHV-2-nPCR positiven Konjunktivalgewebe eines Pferdes und zuvor im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit etablierten In situ-Hybridisierung konnte schließlich gezeigt werden, dass EHV-2 im Augengewebe in der Bindegewebsschicht der Conjunctiva palpebralis präsent ist und hier möglicherweise in spezifischen Immunzellen in Latenz geht.

Several times, an involvement of the Equine Herpesvirus Type 2 (EHV-2) in different forms of inflammatory diseases of the cornea and/or conjunctiva in horses is documented; the exact pathogenesis of equine keratoconjunctivitis has yet not been understood completely. This project focus on the question, whether EHV-2-infected eye-diseased horses possibly show an immune status which differs from the reference value. Besides, the results of this thesis should provide conclusions, if the pathogenesis of the disease is possibly been influenced by immunosuppressive mechanisms of EHV-2. Furthermore, it should be investigated, whether other viral and/or bacterial pathogens play a role in equine keratoconjunctivitis. Finally, the investigations of the ocular tissue- and cell-tropism of EHV-2/-5 should further contribute to the understanding of the pathogenesis of this disease. Investigations of the cellular immune status had been carried out comparing ten eyediseased and 21 clinically sound horses. PBL, isolated from blood samples and swabs from the conjunctival fossa had been investigated using a EHV-2 specific nested PCR. Additionally, serological investigations had been carried out and the cellular immune status of each horse had been determined using flow cytometry and white blood cell count methods. EHV-2 was detected within this study in both, eye- diseased and clinically sound horses by serological methods respectively nPCR. However, a statistically significant correlation between EHV-2 and the characteristic eye-diseased was not observed. Referring to the cellular immune status EHV-2 positive horses without ocular diseases showed significantly more often decreased b-cell numbers than EHV-2 negative horses with and without ocular diseases, respectively. This should be seen as first indication that an EHV-2 infection or reactivation causes a result in a measurable reduction of b-cells. Due to the small sample number, only further investigations will give information about, how individual differences of the immune system may influence the outbreak of keratoconjunctivitis induced by EHV-2. To answer the question, whether other co-factors such as viral or bacterial pathogens are involved in EHV-2 induced equine keratoconjunctivitis, eye-swabs and blood samples from a second investigation group (consisting of 68 eye-diseased and 32 clinically sound horses) had been tested for EHV-2 and subsequently EHV-5, using specific nPCRs. Finally, random samples of eye-swabs had been investigated using pathogen specific PCRs for the presence of EAdV-1, chlamydiae and mycoplasmae, respectively. Within the scope of this project, the EAdV-1 specific nPCR had been established previously. A statistically significant correlation between eye-diseased and sound horses relating to the detection rate of EHV-2 in swab- and blood-samples was also not observed in this investigation group. In addition, evidence for an involvement of EAdV-1, chlamydiae and mycoplasmae, respectively in inflammatory diseases of the cornea and/or conjunctiva of horses could not been deduced. However, it is very likely that EHV-5 is involved in the pathogenesis of equine keratoconjunctivitis as EHV-5-genom was detected frequently in diseased eyes compared with EHV-2, even though there was no observation of a significant correlation between the characteristic eye-diseased . Studies about the tissue- and cell-tropism had been carried out on various ocular tissues (conjunctiva, cornea, nervus opticus and retina) as well as on cytobrush- swabs, which had all been taken post mortem from 14 healthy slaughtered horses. The genome of EHV-2 and -5 had been detected in cytobrush samples and in the conjunctiva only, even though the detection rate was very low (proportion of EHV-2 resp. -5 positive swabs: 11% in each case; proportion of EHV-2 resp. -5 positive conjunctiva: 7 resp. 8%). Finally, the exemplary investigation of a EHV-2-nPCR positive conjunctiva of one horse using the in- situ hybridisation, a method that had been established within the scope of this project revealed, that EHV-2 DNA is present in the submucosa of the conjunctiva palpebralis. Thus, specific cells of the immune system might possibly be a site of latency within this tissue.