Regulation der Calcineurin Gene im menschlichen Herzen bei Myokardhypertrophie, ischämischer und dilatativer Kardiomyopathie

Abstract

Die kardiale Hypertrophie ist einer der wichtigsten klinischen Prädiktoren für die kardiovaskuläre Morbidität und Mortalität. Ebenso sind sowohl das Alter als auch das Geschlecht zwei bekannte kardiovaskuläre Risikofaktoren. In vielen Studien wurde Calcineurin bei der Entstehung der kardialen Hypertrophie eine zentrale Rolle zugewiesen [26, 85]. Aktiviertes Calcineurin besteht aus der katalytischen Untereinheit A (58-59 kDa) und der regulatorischen Untereinheit B (19 kDa). Die Gene für die katalytische Untereinheit befinden sich auf den Chromosomen 4, 10 und 8 und kodieren für die drei Isoformen Calcineurin A α, β und γ respektive. Durch alternatives Spleissen entstehen insgesamt mindestens sieben Spleissvarianten (CnA α 1, 2 und 3, CnA β 1 und 2, CnA γ 1 und 2). Verschiedene Agonisten bewirken über eine intrazelluläre Calciumerhöhung mit Calmodulin die Aktivierung von Calcineurin. Aktiviertes Calcineurin assoziiert mit spezifischen Transkriptionsfaktoren und transloziert mit diesen in den Nukleus, wo sie eine Umstrukturierung der Genexpression mit der Folge der kardialen Hypertrophie bewirken. Die Studie verfolgte das Ziel, die Gen- und Proteinexpression von CnA α und β und seinen Spleissvarianten sowie den Hypertrophiemarkern ANP und BNP in menschlicher kardialer Hypertrophie infolge Aortenstenose und in terminaler, transplantationsbedürftiger Herzinsuffizienz infolge ischämischer und dilatativer Kardiomyopathie zu untersuchen. Die Ergebnisse der Messungen sollten untereinander und in Bezug auf die klinischen Daten der Patienten auf Korrelationen und auf Alters- und Geschlechtsunterschiede untersucht werden. Es wurden linksventrikuläre Myokardproben von 14 Patienten mit Aortenklappenstenose, von 27 Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz aufgrund dilatativer Kardiomyopathie und 7 Patienten aufgrund ischämischer Kardiomyopathie untersucht im Vergleich zu Proben von 15 gesunden Herzen potentieller Spender, die aus technischen Gründen abgelehnt wurden. Nach RNA- Isolation und reverser Transkription erfolgte die semiquantitative Real-Time RT-PCR auf dem TaqMan® PE 5700. Eine externe Standardisierung auf GAPDH wurde vorgenommen. Der Proteinaufarbeitung schloss sich die Proteinbestimmung mittels Western-Blot an. Zwei Spleissvarianten von CnA α zeigten eine signifikante Heraufregulation der m-RNA-Expression in der Gruppe der AS (166 % vs. Kontrollen, p<0,05), während die Messung aller drei Spleissvarianten von CnA α eine signifikante Heraufregulation in der Gruppe der DKMP zeigte (189 % vs. Kontrollen, p<0,05). Beide Messungen der Spleissvarianten von CnA β zeigten jeweils eine stärkere Heraufregulation der m-RNA-Expression in der Gruppe der AS (176 % und 174 % vs. Kontrollen respektive, p< 0,01 und p<0,05 respektive) als in der Gruppe der DKMP (148 % und 150 % vs. Kontrollen respektive, p<0,01 und p<0,05 respektive). Die Messung einer Spleissvariante zeigte zusätzlich eine geschlechtsspezifische Regulation innerhalb der Gruppe der AS mit einer stärker ausgeprägten Heraufregulation bei männlichen als bei weiblichen Patienten, während die Messungen der anderen Spleissvarianten jeweils eine altersspezifische Regulation in der Gruppe der DKMP mit einer stärkeren Heraufregulation bei den jüngeren Patienten (< 40 Jahre) als bei den älteren ergab. Die m-RNA-Expression des Hypertrophiemarkers ANP war stärker heraufreguliert als die von BNP in allen Patientengruppen, und diese Regulation war jeweils am stärksten ausgeprägt in der Gruppe der AS. Die Messung der Proteinexpression von Gesamt-Calcineurin A (nicht isoformenspezifisch) zeigte in keinerlei Hinsicht eine Regulation. Weder zwischen der m-RNA-Expression der Spleissvarianten von CnA und den Hypertrophiemarkern noch zwischen der m-RNA- und der Proteinexpression zeigten sich signifikante Korrelationen. Signifikant positiv korreliert war die m-RNA- Expression der Spleissvarianten untereinander. Zudem war sie signifikant positiv korreliert zu der LVEF und der FS der Patienten und signifikant negativ korreliert zum LVESD und LVEDD der Patienten. Die Regulation der m -RNA-Expression der Spleissvarianten von Calcineurin A unterstreicht dessen Rolle bei der Entstehung und Erhaltung kardialer Hypertrophie [65]. Beim Western Blot sind die Eigenschaften des benutzten Antikörpers zu berücksichtigen (nicht isoformenspezifisch, ev. c-terminale Bindung), die sich auf die Ergebnisse entscheidend auswirken können [38, 68]. Von grösserer Bedeutung könnte hier die Messung der spezifischen Aktivität von Calcineurin sein, um dessen Rolle beim Übergang von kompensierter Hyertrophie zur terminalen Herzinsuffizienz weiter aufzuklären und um dessen Eignung als therapeutisches Ziel zu evaluieren.

Cardial hypertrophy is one of the most important clinical predictors for cardiovascular morbidity and mortality. Also age and gender are two well known cardiovascular risc factors. Many studies have shown that calcineurin plays a central role in the development of cardial hypertrophy. Activated calcineurin consists of the catalytic subunit A (58-59 kDa) and the regulatory subunit B (19 kDa). The genes for the catalytic subunit are found on the chromosomes 4, 10 and 8 and code for the three isoforms calcineurin A α, β und γ respectively. Through alternative splicing at least seven splice variants originate (CnA α 1, 2 and 3, CnA β 1 and 2, CnA γ 1 and 2). Calcineurin is activated by different agonists through an intracellular rise of calcium together with calmodulin. Activated calcineurin then attaches to specific transcription factors and together they translocate into the nucleus, where they cause a change in gene expression which leads to cardial hypertrophy. The aim of this study was to determine the gene and protein expression of calcineurin A α and β and their splice variants and of the markers of hypertrophy ANP and BNP in human cardial hypertrophy following aortic stenosis and in cardiac failure due to ischemic and dilative cardiomyopathy. These results were also checked for correlations between the groups and to clinical parameters of the patients as well as differences in age and gender. Leftventricular samples of myocardium were analyzed from 14 patients with aortic stenosis, from 27 patients with cardiac failure due to dilative cardiomyopathy and from 7 patients with heart failure due to ischemic cardiomyopathy. As controls 15 potential donor hearts were used, which were rejected for technical reasons. After rna-isolation and reverse transcription the semiquantitative real-time rt-pcr was performed on the TaqMan® PE 5700. As external standard gapdh was used. After protein isolation protein measurement was performed using western blot. The m-RNA of two splice variants of calcineurin A α was significantly upregulated in the AS (166 % vs. controls, p<0,05), while the measurement of all three splice variants of calcineurin A α showed a significant upregulation in the DCMP (189 % vs. controls, p<0,05). The calcineurin A β results showed a stronger upregulation of m-RNA in the AS (176 % and 174 % vs. controls respectively, p< 0,01 and p<0,05 respectively) than in the DCMP (148 % and 150 % vs. controls respectively, p<0,01 and p<0,05 respectively). One splice variant showed a gender specific regulation in the AS with a stronger upregulation in the male patients, while another splice variant an age specific regulation showed in the DCMP with a stronger upregulation in the younger patients (< 40 ys.). The m-RNA expression of ANP was stronger upregulated than BNP in all patients, especially in the AS. The results of the protein expression of calcineurin A (not isoform specific) showed no regulation at all. No correlation was found between the m-RNA expression of the calcineurin A splice variants and the markers of hypertrophy nor between m-RNA expression and the protein expression. There was a significantly positive correlation between the m-RNA expression of the calcineurin A splice variants and they were significantly positive correlated to the LVEF and FS and significantly negative correlated to LVESD and LVEDD. The regulation of the m-RNA expression of the calcineurin A splice variants emphasizes it`s role in the development and maintainance of cardiac hypertrophy. When using western blot the characteristics of the antibody need to be considered (isoform specific, c-terminal binding), which can have critical effects on the results. Of greater importance may be the measurement of the specific activity of calcineurin to evaluate it`s role in the transition from compensated hypertrophy to heart failure and it`s eligability as a therapeutical target.