Microevolution of epidemiological highly relevant non-O157 enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)

Abstract

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are the cause of diarrhea, bloody diarrhea, hemorrhagic colitis (HC) and the potentially fatal hemolytic uremic syndrome (HUS) in humans. The key virulence factor of EHEC is the bacteriophage-encoded Shiga-Toxin gene (stx). In addition, EHEC can harbor the locus of enterocyte effacement (LEE), which is located on a pathogenicity island, and coffers the ability to cause attaching and effacing (A/E) lesions on epithelial cells as a result of colonization of the intestinal tract. The most common EHEC serotype isolated worldwide is O157:H7. Nevertheless, a variety of non-O157 EHEC have emerged as serious causes of HUS and diarrhea in humans worldwide. The most important non-O157 O serogroups causing one third of the EHEC infections in Germany, are O26, O103, O111 and O145. We hypothesized that these non-O157 differ in their phylogeny and aimed to determine the underlying microevolution leading to the emergence of such non-O157 EHEC. In this thesis I provide evidence to explain the population structure of the two most-important non-O157 EHEC, O26 and O111 EHEC, and further propose a model of the microevolution of these EHEC, including also the common ancestor of both lineages. The microevolutionary model of O26 and O111 EHEC is based on results of several analyses of the genome of a large collection of non-O157 EHEC strains and the crucial inclusion of atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) into this collection. Application of multilocus sequence typing (MLST) on a diverse collection of 250 non-O157 STEC and EHEC revealed a cluster formation of strains of O serogroups O26 and O111 in one single sequence type complex, STC29. The additional presence of aEPEC, that differ from STEC/ EHEC merely in their absence of the stx-converting bacteriophage, but share the same O serogroups, among the STEC/ EHEC strains in common sequence types (STs) of STC29, suggests an ongoing microevolutionary scenario, characterized by a bidirectional-conversion, in which the phage- encoded stx-gene is transferred between aEPEC and STEC/ EHEC. To test this hypothesis, we performed whole genome sequencing of 99 selected strains (aEPEC n=20, STEC/ EHEC n=79) designated as STC29 and analyzed the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the maximum common genome (MCG) of those strains in order to gain more detailed information on the underlying population structure and microevolution. The resulting minimum spanning tree (MSTree) of the MCG- based SNP-analysis revealed three distinct clusters. Cluster 1 harbored strains of O serogroup O111 also designated as ST16 with MLST. Interestingly, the distinct Cluster 2 included only O26 aEPEC strains of ST29, while the more heterogeneous Cluster 3 combined STEC/ EHEC as well as aEPEC strain of O serogroup O26 that were only roughly separated into strains of ST29 and ST21. The analysis of the presences or absence of accessory virulence associated genes (VAGs) confirmed the results of the SNP-analysis, and suggests a parallel evolution of the MCG of those strains and the acquisition of virulence genes. Furthermore, the analysis of insertion sites for mobile genetic elements, with respect to their occupation with phage-related genes and insertion elements, resulted in a similar relation of the analyzed strains. Consequently, the common results of MLST, SNP-analysis of the MCG, the presence of VAGs and occupation of insertion sites led to the development of a microevolutionary model of STEC/ EHEC of O serogroups O26 and O111, which developed as two distinct lineages from a common aEPEC ancestor of ST29 by lysogenic conversion with stx-converting bacteriophages. Moreover, these analyses and the development of the microevolutionary model were performed on human (n=53) and bovine (n=45) STEC/ EHEC and aEPEC strains, representing the most important hosts of such strains. None of the analyses revealed a separated grouping of strains based on host species. Hence, these strains do not appear to harbor host-specific genomic alterations, neither within the MCG nor in the acquired VAGs, and therefore do not appear to emerge by adaptation to a specific niche. These results strongly support the zoonotic nature of aEPEC and STEC/ EHEC. In conclusion, STEC/ EHEC of O serogroups O26 and O111 originate from a common ancestor, further aEPEC and STEC/ EHEC of those serogroups share a common phylogeny and are bona fide zoonotic agents.

Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) verursachen Infektionen des menschlichen Intestinaltraktes und führen zu Durchfall, blutigem Durchfall, hämorrhagischer Kolitis und dem potentiell tödlichen, hämolytisch urämischen Syndrom (HUS). Das Bakteriophagen-kodierte Shiga-Toxin-Gen (stx) ist der wichtigste Virulenzfaktor von EHEC. Zusätzlich können EHEC eine Pathogenitätsinsel, den sogenannten ‚locus of enterocyte effacement‘ (LEE) besitzen, durch den sie bei der Besiedlung des Intestinaltraktes ‚attaching and effacing‘ (A/E) -Läsionen an Epithelzellen verursachen. Der am weltweit häufigsten isolierte EHEC-Serotyp ist O157:H7, aber eine Vielzahl von non-O157 EHEC wurde weltweit von Patienten mit Durchfallerkrankungen sowie HUS isoliert. Die wichtigsten non-O157 O-Serogruppen, die auch ein Drittel der EHEC-Infektionen in Deutschland verursachen, sind O26, O103, O111 und O145. Wir nehmen an, dass diese non-O157 EHEC unterschiedliche Phylogenien aufweisen und beabsichtigen, das zu Grunde liegende mikroevolutionäre Szenario, dass zur Entstehung dieser Stämme führte, aufzuklären. In dieser Dissertation konnten wir nicht nur die Populationsstruktur der zwei wichtigsten non-O157 EHEC, nämlich O26 und O111 EHEC, aufklären, sondern auch ein Modell für die Mikroevolution dieser EHEC, einschließlich des gemeinsamen Vorgängers beider Abstammungslinien, vorstellen. Das mikroevolutionäre Modell der O26 und O111 EHEC basiert auf den Ergebnissen einer Vielzahl von Analyseschritten die an den Genomsequenzen einer großen Sammlung von non-O157 EHEC durchgeführt wurden. Hierbei war vor allem die Einbeziehung von atypischen enteropathogenen Escherichia coli (aEPEC) in die Analysen von großer Wichtigkeit. Zuerst führten wir eine Multilokus Sequenztypisierung (MLST) von 250 non-O157 EHEC und Shiga-Toxin produzierenden E. coli (STEC) durch, und stellten eine Anhäufung von Stämmen der O-Serogruppen O26 und O111 in einem einzigen Sequenztypkomplex fest, STC29. Genau wie STEC/ EHEC-Stämme des STC29, wurden aEPEC-Stämme ebenfalls den einzelnen Sequenztypen von STC29 zugeordnet; diese aEPEC unterscheiden sich von STEC/ EHEC nur durch die Abwesenheit des stx- konvertierenden Bakteriophagen und weisen ebenfalls die gleichen O-Serogruppen wie STEC/ EHEC auf. Die Akkumulation dieser Pathotypen in gleichen STen weist auf ein zu Grunde liegendes mikro-evolutionäres Szenario hin, genauer auf bidirektionale Konversion, bei der das Phagen-kodierte stx-Gen zwischen aEPEC und STEC/ EHEC übertragen wird. Um diese Hypothese zu testen, wurden 99 Stämme, des STC29 (aEPEC n=20, STEC/ EHEC n=79), Ganzgenom-sequenziert und anschließend Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) des größten gemeinsamen Genanteils aller Stämme (‚maximum common genome‘, MCG) analysiert um bessere Einblicke in die Populationsstruktur dieser Stämme zu erlangen. In dem resultierenden ‚Minimum Spanning Tree (MSTree)‘ der MCG-basierten SNP-Analyse zeigten sich drei klar abgetrennte Cluster. Cluster 1 umfasste alle Stämme der O-Serogruppe O111, die durch MLST zusätzlich als ST16 bestimmt wurden. Cluster 2 fasste interessanterweise ausschließlich O26 aEPEC des ST29 zusammen, wohingegen das heterogenere Cluster 3 STEC/ EHEC und aEPEC der O-Serogruppe O26 beinhaltet, die entweder als ST29, oder als ST21 bestimmt wurden. Die Analyse des Vorhandenseins von Virulenz-assoziierten Genen (VAGen) des akzessorischen Genoms bestätigte die Ergebnisse der SNP-Analyse und deutet darauf hin, dass die Evolution des MCG dieser Stämme und die Aufnahme von VAGen parallel verliefen. Des Weiteren wurden bekannte Insertionsstellen in diesen Stämmen auf die Integration von mobilen genetischen Elementen, also Phagen oder anderen Insertionselementen, hin untersucht. Die sich ergebende Populationsstruktur war erneut vergleichbar mit den vorangegangenen Ergebnissen. Die übereinstimmenden Ergebnisse von MLST, SNP-Analyse des MCGs, Vorhandensein von VAGen und Integration von mobilen genetischen Elementen dienten als Grundlage für die Entwicklung eines Mikroevolutions-Modells von STEC/ EHEC der O-Serogruppen O26 und O111. Nach diesem Modell entwickelten sich O26 und O111 STEC/ EHEC in zwei Abstammungslinien von einem gemeinsamen Vorgänger, einem aEPEC des STs 29, vermutlich durch lysogene Konversion mit einem stx-konvertierenden Bakteriophagen. Die Analysen bzw. die Entwicklung des Modells wurden zudem mit humanen (n=53), als auch mit bovinen (n=45) STEC/ EHEC und aEPEC Stämmen durchgeführt und repräsentieren somit die häufigsten Wirte dieser Stämme. Da keine der Analysen eine separate Gruppierung von Stämmen eines Wirtes aufzeigte, weisen die Stämme also keine wirtsspezifische Anpassung des Genoms, weder des MCGs noch bei den akzessorischen VAGen, auf und haben sich folglich nicht durch Anpassung an eine bestimmte Nische entwickelt. Darüber hinaus belegt das Fehlen von wirtsspezifischen Clustern auch den zoonotischen Charakter von aEPEC und STEC/ EHEC der genannten Serotypen. Abschließend lässt sich sagen, dass STEC/ EHEC der O-Serogruppen O26 und O111 von einem gemeinsamen Vorgänger abstammen, aEPEC und STEC/ EHEC dieser O-Serogruppen eine gemeinsame Phylogenie aufweisen, und bona fide Zoonoseerreger sind.