Tumorzellgehalt in Glioblastomen: Zu TERT-Promotormutationen, MGMT-Methylierung und prognostischer Bedeutung von 'Reinheit' in GBM

Abstract

Mit der vorliegenden Studie ist es gelungen, die Entwicklung und den Einsatz einer quantitativen, allelspezifischen real-time PCR (qAS-PCR) zur Bestimmung von Genotyp und mutanter Allelfrequenz von Telomerase-Promotor-Mutationen (pTERT-Mutationen) als direktes Maß für den Tumorzellgehalt in Glioblastomen (GBM) nachzuweisen. Da der Tumorzellgehalt als möglicher Einflussfaktor auf die genaue Bestimmung anderer Biomarker in Glioblastomen gilt, wurde in der vorliegenden Arbeit der Zusammenhang zwischen Tumorreinheit und der O-6 -Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) in Gewebeproben aus Glioblastomen systematisch untersucht. Zugleich ist der Promotor-Methylierungsstatus des DNA-Reparaturenzyms MGMT ein wichtiger Biomarker in Glioblastomen: Zum einen hängen Therapiemöglichkeiten und -ansprechraten davon ab, zum anderen gilt er als wichtiges Einschlusskriterium für klinische Studien. Daher werden in dieser Untersuchung Tumorzellgehalt, pTERT-Mutationen durch Sanger- Sequenzierung, MGMT-Methylierung durch Pyrosequenzierung, IDH1-Mutationsstatus und klinische Parameter in einer Kohorte von high-grade Gliomen (n=97) systematisch analysiert. Es zeigt sich, dass die qAS-PCR im Vergleich mit unabhängigen Methoden zuverlässig sowohl Genotyp als auch Tumorzellgehalt prognostiziert. Der Tumorzellgehalt korreliert darüber hinaus positiv und signifikant mit dem Ausmaß der Methylierung in MGMT-methylierten GBM. Dieses Ausmaß zeigt zugleich signifikant unterschiedlich hohe Level für beide Mutation-Hotspots (C228T vs. C250T). Abschließend konnte der Tumorzellgehalt als ein unabhängiger prognostischer Marker in GBM identifiziert werden. In der Gesamtschau konnten nicht nur Zusammenhänge zwischen Tumorzellgehalt, pTERT- Mutationen und MGMT-Methylierung nachgewiesen werden; darüber hinaus belegt diese Studie auch, dass das Ausmaß der MGMT-Methylierung den Tumorzellgehalt widerspiegelt und der Tumorzellgehalt selbst als prognostisch bedeutsam in IDH1-Wildtyp-GBM betrachtet werden muss.

Promoter methylation status of O-6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT), a DNA repair enzyme, is a critical biomarker in glioblastoma multiforme (GBM) as treatment decisions and clinical trial inclusion rely on its accurate assessment. However, interpretation of results is complicated by poor inter- assay reproducibility as well as weak a correlation between methylation status and expression levels of MGMT. The present study systematically investigates the influence of tumor purity on tissue subjected to MGMT analysis. A quantitative, allele-specific real-time PCR (qAS-PCR) assay was developed to determine genotype and mutant allele frequency of telomerase promoter (pTERT) mutations as a direct measure of tumor purity. We studied tumor purity, pTERT mutation by Sanger sequencing, MGMT methylation by pyrosequencing, IDH1 mutation status, and clinical parameters in a cohort of high-grade gliomas (n=97). The qAS-PCR reliably predicted pTERT genotype and tumor purity compared with independent methods. Tumor purity positively and significantly correlated with the extent of methylation in MGMT methylated GBMs. Extent of MGMT methylation differed significantly with respect to pTERT mutation hotspot (C228T vs. C250T). Interestingly, frontal lobe tumors showed greater tumor purity than those in other locations. Above all, tumor purity was identified as an independent prognostic factor in GBM. In conclusion, we determined mutual associations of tumor purity with MGMT methylation and pTERT mutations and found that the extent of MGMT methylation reflects tumor purity. In turn, tumor purity is prognostic in IDH1 wildtype GBM.