Einfluß des surfactantassoziierten Proteins B auf die Aufnahme von Lipiden in Typ II-Zellen im Vergleich mit und ohne das surfactantassoziierte Protein A

Abstract

Spezielle Lungenepithelzellen, die Typ II-Pneumozyten, produzieren Surfactant, welches als dünner Film die Alveolen der Lunge auskleidet und die Oberflächenspannung an der Luft- Wassergrenze der Alveoli herabsetzt. Das Surfactant setzt sich zu 90% aus Lipiden und 10% aus surfactantassoziierten Proteinen zusammen. Letztere werden als SP-A, SP-B, SP-C und SP-D bezeichnet. Das Surfactant wird von den Zellen über Exozytose sezerniert und über Endozytose wieder aufgenommen. In der Klinik wird natürliches und synthetisch hergestelltes Surfactant seit Jahren erfolgreich in der Behandlung des IRDS (infant respiratory distress syndrome) des Neugeborenen eingesetzt. Intensiv wird am Einsatz von Surfactant beim ARDS (acute respiratory distress syndrome) des Erwachsenen geforscht. Die Weiterentwicklung bzw. Verbesserung eines funktionsfähigen Surfactant erfordert genaue Kenntnisse seiner Bestandteile und deren Funktionsweisen sowie bestehender Regulationsmechanismen. Gegenstand dieser Arbeit ist die Endozytose von Lipiden an frisch isolierten Typ II- Zellen in vitro, dabei interessierte uns insbesondere der Einfluß des surfactantassoziierten Proteins B (SP-B) auf die Lipidaufnahme der Typ II- Pneumozyten. Es wurde untersucht, ob die Lipidaufnahme mit SP-B auch über clathrin coated pits (CCP) und clathrin coated vesicles (CCV) erfolgt, wie es für SP-A und assoziiertes Lipid beschrieben wurde. Desweiteren erfolgte die Aufklärung der Abhängigkeit der Endozytose mit SP-B von Tubulin, welches sich bei zahlreichen Endozytosevorgängen als essentiell erwiesen hat. Der letzte Forschungsschwerpunkt dieser Arbeit bei der Endozytose von Lipiden mit SP-B war die Rolle spezieller Signaltransduktionskaskaden, wie sie für die Sekretion von Surfactant beschrieben worden sind. Dazu haben wir in vitro Aufnahmeversuche an Typ II-Zellen durchgeführt. Um den physiologischen Bedingungen in vivo möglichst nahe zu kommen, wurden bei unseren Experimenten frisch isolierte Typ II-Pneumozyten eingesetzt. Die dabei verwendeten surfactantassoziierten Proteine (SP-A und SP-B) wurden in aufwendigen Schritten isoliert und auf Verunreinigung getestet. Die Lipidaufnahme wurde als Verhältnis der in den Typ II- Zellen gemessenen Radioaktivität (dpm) und des bestimmten Proteingehaltes der Zellen (µg) ausgedrückt. Unsere Ergebnisse zeigen, daß die Lipidaufnahme mit Zusatz von SP-B geringer ist als die Lipidaufnahme ohne surfactantassoziierte Proteine. Die widersprüchlichen Ergebnisse einzelner Arbeitsgruppen diesbezüglich können durch unterschiedliche Versuchsbedingungen (frische versus kultivierte Zellen, Isolationsmethoden insbesondere von SP-B, stark variierende Protein-Lipid- Ratios der Liposomen) erklärt werden und führen zu einer scheinbar großen Variationsbreite der Ergebnisse mit SP-B, wie sie durch Horowitz et al. bereits postuliert worden ist. Weiterhin konnten wir zeigen, daß die Lipidaufnahme mit SP-B weder clathrin- noch tubulinabhängig ist und sich sowohl von der Lipidaufnahme ohne surfactantassoziierte Proteine als auch von der Lipidaufnahme mit SP-A unterscheidet. Die bei der Sekretion von Surfactant bereits untersuchte Signaltransduktionskaskaden Adenylatcyclase (AC) mit dem second messenger cAMP, Phospholipase C (PLC) mit dem second messenger IP3, Proteinkinase C (PKC) und die Involvierung der G-Proteinen haben wir bei der Endozytose der Lipide untersucht. Dabei konnten wir zeigen, daß der Einfluß der AC mit cAMP bei der Lipidaufnahme mit SP-B eine Rolle spielt. Dieser Signaltransduktionsweg scheint jedoch bei der Lipidaufnahme ohne surfactantassoziierte Proteine und bei der Lipidaufnahme mit SP-A nicht involviert zu sein. Die Signaltransduktionsmechanismen der PLC mit IP3, PKC und die G-Proteine sind nach den uns vorliegenden Ergebnissen bei der Endozytose von Lipiden in An- und Abwesenheit von SP-A bzw. SP-B nicht beteiligt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Hypothese von Griese et al., daß die Regulation der Surfactantaufnahme von der Regulation der Sekretion unabhängig ist. Anhand der dargestellten Ergebnisse vermuten wir, daß die Lipidaufnahme mit SP-B über einen speziellen, rezeptorunabhängigen Weg erfolgt, der sich von dem der Lipide allein bzw. von dem mit SP-A unterscheidet. Dieser Endozytoseweg mit SP-B könnte dem "lamellarbodygetriggerten" Aufnahmeweg für Surfactant entsprechen, der von der Arbeitsgruppe um Shuman als aktinabhängig beschrieben wurde.

Surfactant (surface active agent) covers the alveoli of the lung and lowers the surface tension on the air-water-interface. Surfactant is a complex mixture and contains about 90% of lipid and 10% of surfactant associated proteins. Specialized lung epithelial cells, the alveolar type II cells, produce surfactant. The cells do secretion and uptake by processes called exo- and endocytosis. For decades native and synthetic preparations of surfactant have been an effective medicine in IRDS (infant respiratory distress syndrome). Encouraging results prove the effect of surfactant in adults with severe respiratory failure ARDS (adult respiratory distress syndrome). However, for best quality of surfactant preparations, details about the function of the ingredients as well as regulating mechanism are essential. In following study we examined the endocytosis of lipid in the presence of surfactant proteins SP-B and SP-A in freshly prepared alveolar type II cells. Previous studies have demonstrated, that SP-A and aggregated lipid are internalized via coated pits and coated vesicles. The aim of this study was to analyze the endocytotic way of SP-B and associated lipid in comparison to lipid without surfactant proteins and lipid in association with SP-A. Does it use the way via coated pits and vesicles? Does the uptake with SP-B depend on tubuline, a certain cytosceletal protein? Several signal transduction mechanisms have been published to be involved in the secretion of surfactant. Because of the great variety of signaling mechanisms we focused our investigation on already described pathways playing a role in exocytosis. For best possible imitation of physiological principles we used freshly isolated alveolar type II cells. The used liposomes did mimic natural surfactant in their lipid composition and protein- lipid-ratio (1:75). The surfactant proteins SP-A and SP-B were extracted in complex procedures and were tested for purity as well as for contamination. The uptake of lipid is expressed as the ratio of the counted radioactivity (dpm) and the protein content of the cells (µg). The results show that the incorporation of SP-B does reduce the uptake of lipid (surfactant like liposomes). Both proteins SP-B and SP-C have been demonstrated to enhance lipid uptake in vitro (Horowitz et al.). But on the other hand SP-B was able to reduce lipid uptake produced by SP-C (Horowitz et al.). The contradictory results according to SP-B can be explained by the diverse methods and techniques used (freshly prepared versus cultured cells, isolation and purity of SP-B, liposome preparation with significant variating protein-lipid- ratios, incubation time). Thus leads to a great variability of results related to SP-B. The uptake of lipid associated with SP-B (SP-B containing liposomes) does not involve clathrin or tubuline. We find the AC with the second messenger cAMP to be involved in endocytosis with SP-B . The following investigated signal transduction pathways seem not to play a role in uptake of SP-B and associated lipid: PLC with the second messenger IP3, PKC and G-proteins. The AC with cAMP is not involved in the endocytosis of lipid associated with SP-A. The same applies for lipid without surfactant proteins. Conclusions: SP-B does influence the uptake of lipids in vitro. Clathrin or tubuline are not responsible for endocytosis of SP-B and associated lipid. Furthermore the signal transduction system using AC and cAMP seems to be involved in the endocytosis of lipid with SP-B, but not in the endocytosis of lipid without surfactant proteins as well as of lipid and SP-A. From these results it can be concluded that the uptake of lipid associated with SP-B differs from the endocytosis of lipid alone and from lipid with SP-A. This uptake pathway is possible to correspond to the actin dependent endocytosis involving lamellar body membrane like postulated by Shuman et al.