Der Einfluss von Sauerstoff auf die Entwicklung von Oligodendroglia

Abstract

Oligodendroglia sind Zellen des zentralen Nervensystems, die die Myelinisierung signalleitender Zellen gewährleisten. Ihre Entwicklung ist kompliziert und vor Allem bei Frühgeborenen zum Zeitpunkt der Geburt noch nicht abgeschlossen. Oligodendrogliäre Voläufer Zellen (OPC) sind sehr sensibel gegenüber oxidativer Toxizität. Da die Sauerstoffsättigung des Hirnparenchyms in vivo nur 3-7% beträgt haben wir postuliert, dass die allgemeinhin verwendeten 21% O2 der Raumluft in Zellkultururen eine oxidative Herausforderung für OPCs darstellt. Eine typische zelluläre Reaktion auf sich verändernde Sauerstoffkonzentrationen ist die Regulation von Hypoxia Inducible Factor 1 alpha (HIF-1α). Es ist bekannt, dass HIF-1α verschiedene Entwicklungsprozesse, wie zum Beispiel die Proliferation und die Reifung von OPCs beeinflusst. Sauerstoff kann außerdem Oxidativen Stress hervorrufen. Wir haben primäre Ratten OPCs und Zellen der Oligodendrogliären Zellreihe OLN93 für 48 und 96 Stunden bei 5% und 21% O2 kultiviert und dann Immunozytochemie mit Antikörpern gegen A2B5 und O4 durchgeführt. Proliferation wurde mittels Ko-Färbung mit Ki67 quantifiziert und Apoptose mittels TUNEL Ko- Färbung detektiert. Genexpression spezifischer oligodendrogliärer Transpkriptionsfaktoren Olig1, Olig2, Sox9 und Sox10, sowie die der Reifungs Marker MBP und CNP wurde durch Realtime qPCR ermittelt. Die oxidative Beanspruchung der Zellen wurde durch die Genexpression von NRF2, SOD2 und Nitrotyrosin Western Blot beurteilt. Die Morphologie der OPC, welche in 5% O2 kultiviert wurden unterschied sich maßgeblich von der solcher Zellen, die in 21% O2 kultiviert wurden. Nach 48 Stunden zeigten O4+ Zellen in 5% O2 mehr und komplexere Zellforsätze, während OPCs in 21% O2 weit weniger differenzierte Strukturen aufwiesen, wie sich durch Sholl-Analyse zeigte. Die Genexpression von MBP, CNP, Olig1 und Olig2 war reduziert und antioxidantische Gene signifikant hoch reguliert nach 48 Stunden in 21% O2. Erhöhte Nitrotyrosin Level deuteten auf oxidativen Stress hin. Während sich kein Unterschied in der Menge an Zelltod zeigte, proliferierten die Zellen in 5% O2 signifikant mehr als in 21% O2. Luciferease reporter assay in transfizierten OLN93 Zellen zeigte eine erhöhte HIF-1α Aktivität bei 5% O2. In OLN93 welche in 5% O2 kultiviert wurden führte ein HIF-1α-knockdown darüber hinaus zu einer Abnahme der Expression der Reifungsmarker MBP und CNP, die dann etwa der Expression von in 21% O2 kultivierten Zellen entsprach. Dies zeigt, dass 21% O2 die Entwicklung von Oligodendroglia in vitro mindert und dass sowohl oxidativer Stress als auch HIF-1α Dysregulation zugrundeliegende Mechanismen darstellen könnten.

Oligondendroglia are cells of the central nervous system accounting for the myelinisation of signal transducing cells. Their development is a complex process not terminated at birth, especially not in prematurely born infants. Oligodendroglial precursor cells (OPCs) are highly susceptible to oxygen toxicity. As the in vivo oxygen saturation of the brain parenchyma is 3-7% we hypothesized that the 21% oxygen in room air commonly used in cell cultures may pose an oxygen challenge to OPCs. A classical cellular response to different oxygen concentrations is the adjustment of Hypoxia Inducible Factor 1 alpha (HIF-1α) activity. HIF-1α is known to influence several developmental processes such as proliferation and maturation. Oxygen can moreover cause oxidative stress. We cultured primary rat OPCs and cells of the oligodendroglia linage cell line OLN93 for 48 and 96 hours at 5 % and 21 % O2 and performed immunocytochemistry with antibodies against A2B5+ and O4+. Proliferation was quantified using Ki67 antibodies, TUNEL staining was applied to detect apoptosis. Gene expression of specific oligodendroglial transcription factors Olig1, Olig2, Sox9, Sox10, and also of maturation markers MBP and CNP were determined by realtime qPCR. Oxidative challenge in the cultures was assessed by gene expression Analysis of NRF2 and SOD2 and by Western blot analysis of nitrotyrosine. The role of HIF1a was investigated by HIF-1α luciferase reporter assay and comparison of results to cells with knockdown of HIF-1α. Morphology of OPCs differed between 21 % and 5 % O2 culture condition. After 48 hrs culture time, O4+ OL often showed multiple and complex processes at 5 % but had a much less differentiated structure at 21 % O2, as was revealed by Sholl analysis. Expression of MBP, CNP, Olig1, and Olig2 was significantly reduced, and antioxidant genes were significantly up- regulated after 48h at 21 % O2. Increased nitrotyrosine indicated oxidative stress at 21 % O2. There was no difference in apoptosis. At 21% O2, proliferation was reduced in OPCs and in OLN93 cells. Luciferease reporter Assay in transfected OLN93 cells indicated increased HIF-1α activity at 5 % O2. In OLN93 cells kept at 5 % O2, knockdown of HIF-1α caused a decrease in the expression of maturation markers MBP and CNP which was similar to that found at the higher oxygen level of 21 % O2. 21 % O2 impairs oligodendroglial development in vitro and oxidative stress and HIF-1α dysregulation seem to represent underlying mechanisms.