Untersuchung zur gewebsspezifischen Genexpression in einem Tiermodell für Schlaganfall

Abstract

Differential Display of mRNA (DD) stellt in der molekularen Medizin eine Methode für die Erforschung komplexer polygenetisch und multifaktoriell bedingter Erkrankungen dar. DD erlaubt den Vergleich der Genexpression unterschiedlicher Gewebe auf einer PCR-basierenden Methode mit dem Ziel der Identifizierung und Isolierung von quantitativ unterschiedlichen Transkripten. Ziel der Forschungsarbeit war die Identifizierung und Isolierung von Genen, die bei der Pathogenese des Schlaganfalls eine potentielle Rolle spielen. Um genetischen Faktoren aufzudecken und den molekularen Mechanismus zu verstehen, der zum Schlaganfall führt, wurde die zum Schlaganfall neigende spontan hypertensive Ratte (SHRSP) als ingezüchtetes Tiermodell für eine komplexe cerebrovaskuläre Form von Schlaganfall verwendet. Als Vergleich diente die eng verwandte spontan hypertensive Ratte (SHR), die resistent gegenüber Schlaganfall ist. Bluthochdruck, von dem beide Rattenstämme betroffen sind, und eine natriumreiche und kaliumarme Diät sind Faktoren, die das Auftreten von Schlaganfall in SHRSP bedingen, aber keinen Einfluss auf SHR ausüben. Die Schlaganfall-induzierende Diät wird so als Ursache für krankheitsrelevante Veränderungen in der Genexpression im Gehirn bei SHRSP vermutet. Es wurde eine große Zahl an potentiell unterschiedlich exprimierten Gensequenzen isoliert, von denen zwei mit „houskeeping-gene“ normalisiertem RNase Protection Assay als wirklich unterschiedlich exprimiert verifiziert werden konnten. Eine der Sequenzen repräsentiert die mRNA für den Thyreotropin Releasing Hormon (TRH)-Rezeptor der Ratte, die andere ein bislang unbekanntes Gen. Die Menge an mRNA für den TRH-Rezeptor im Gehirn von SHRSP war fast doppelt so hoch wie im Gehirn von SHR und zeigte einen weiteren Anstieg im Gehirn von mit der Diät behandelten SHRSP. Dies deutet darauf hin, dass der TRH-Rezeptor möglicherweise aufgrund einer Überregulation an der Pathogenese des Schlaganfalls bei mit der Diät behandelten SHRSP beteiligt ist. Das unbekannte Gen war deutlich exprimiert in SHR, die die Diät erhielten. Niedrige Mengen wurden im Gehirn von SHRSP gefunden, konnten jedoch nicht in mit der Diät behandelten SHRSP nachgewiesen werden. Dies könnte auf eine schützende Funktion dieses Gen hinweisen. Mit Hilfe eines Somatic Cell Hybrid Panels konnte diese Sequenz auf Chromosom 4 der Ratte lokalisiert werden. Frühere Ergebnisse heben drei Regionen auf Chromosom 1, 4 und 5 der Ratte hervor, die ursächlich für den Schlaganfall in diesem Tiermodell verantwortlich sind. Diese Sequenz stellt so ein neues Kandidatengen für die Genregion auf Chromosom 4 dar. Die Untersuchungen dokumentieren die Möglichkeiten von DD für die Erforschung komplexer Erkrankungen. Es konnten zwei Gene identifiziert werden, die möglicherweise funktionell relevant für die Ausbildung von Schlaganfall in diesem Tiermodell sind. Eine Charakterisierung dieser Gene wird neue Erkenntnisse über die an der Pathophysiologie des Schlaganfalls beteiligten genetischen Faktoren bringen. Die Übertragung der Ergebnisse auf den Menschen mag dazu beitragen, ursächlich verantwortliche Gene für den Schlaganfall auch im Menschen zu identifizieren.

Stroke is a complex disorder with a multifactorial and polygenic etiology which is associated with long term disability and high mortality. To understand the molecular mechanisms associated with stroke and to elucidate the contributing genetic factors we used the stroke-prone spontaneously hypertensive rat (SHRSP) as an inbred animal model for a complex form of stroke resembling the human disease. As a reference, we used the closely related spontaneously hypertensive rat (SHR) which is resistant to stroke. Hypertension - present in both strains - and a high-Na/low-K diet are prerequisites and trigger the occurrence of stroke in SHRSP, but not in SHR. We reasoned that the stroke-permissive diet would induce disease-relevant changes in gene expression in the brain and/or the cerebral vasculature, and performed mRNA differential display (DD) on these tissues from both strains. We isolated a large number of differentially expressed bands, of which two were validated by direct expression analysis using housekeeping-gene- normalized ribonuclease protection assay (RPA). One of them represents the mRNA encoding the rat thyrotropin releasing hormone receptor, the other one a novel gene. mRNA levels for thyrotropin releasing hormone receptor in brains of SHRSP were found to be two-fold higher than in SHR, and were further increased in SHRSP fed the high-Na/low-K diet. The novel sequence was not detected in the brain of SHR at baseline, but was induced after exposure to the stroke-promoting diet. Low levels of the uncharacterized mRNA were found in the brains of SHRSP fed with the normal diet, while expression was no longer detected after dietary manipulation. Using a somatic cell hybrid panel the unknown sequence was localized to rat chromosome 4. Previous results indicate the presence of at least three stroke-related gene loci on chromosome 1, 4 and 5. Thus, the newly identified cDNA represents a novel candidate gene for the gene locus on chromosome 4. In Conclusion, our observations indicate the feasibility of the DD approach for complex disorders, and pinpoint two genes that may be functionally relevant in this animal model of stroke. Further characterization of genes linked to stroke in these animal models will provide a new insight into the genetic factors contributing to the pathophysiology of the disease, and may help to identify causative genes for stroke in humans.