Wirkmechanismen von Antithymozytenglobulin: Untersuchungen an hämatopoetischen Zellen und Patienten mit hämatopoetischer Insuffizienz

Abstract

Antithymozytenglobulin (ATG) ist das Mittel der Wahl bei der immunsuppressiven Therapie von aplastischen Anämie (AA) Patienten, die nicht für eine allogene Knochenmarktransplantation (KMT) geeignet sind. Studien zeigten auch eine Wirkung von ATG bei Subgruppen von Patienten mit low-risk myelodysplastischen Syndromen (MDS). Bislang ist unklar, welche Komponenten und welche Mechanismen für die Wirksamkeit des ATG bei der AA und den MDS verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde die Wirkung des ATG auf Apoptose und Proliferation an hämatopoetischen Zellen untersucht. ATG ist in der Lage, in malignen lymphatischen und myeloischen Zelllinien unterschiedlichen Differenzierungsgrades und Ursprungsgewebes Apoptose auszulösen. Obwohl sich die untersuchten Zelllinien unterschiedlich sensibel zeigten, konnte eine Apoptoseinduktion bei den meisten Zelllinien durch therapeutisch erzielbare ATG Konzentrationen erzielt werden. Auch Koinkubationsexperimente mit ATG und Etoposid oder G-CSF sowie Cyclosporin A zeigten keine Veränderung des Anteils apoptotischer Zellen. Untersuchungen zur Beteiligung des CD95-Rezeptors im Rahmen der ATG-induzierten Apoptose zeigten, dass die eingesetzten ATG-Chargen keine- mit den angewandten Methoden nachweisbare- CD95-Antikörper enthielten. Auch die Inkubation der Zellen mit ATG führte zu keiner veränderten Expression des CD95-Rezeptors auf diesen Zellen. Die ATG-induzierte Apoptose konnte weder durch CD95-Induktion erhöht, noch durch Blockierung des CD95-Rezeptors gehemmt werden. Somit konnte das CD95-System als Hauptmechanismus der ATG-vermittelten Apoptose ausgeschlossen werden. Bei Untersuchungen zur Beteiligung von Caspasen konnte eine deutliche Aktivierung dieser, insbesondere der Caspase-3 festgestellt werden. Eine Reduktion des Anteils ATG-induzierter apoptotischer Zellen durch Koinkubation mit dem Caspasen-Inhibitor Z-DEVD-FMK wurde jedoch nicht erreicht. Dies könnte auf die Beteiligung Caspasen-unabhängiger Mechanismen bei der ATG-induzierten Apoptose hinweisen oder durch nicht ausreichende Hemmung aller involvierten Caspasen durch Z-DEVD-FMK bedingt sein. Neben der Apoptoseinduktion wurde für ATG auch eine apoptoseunabhängige Proliferationsinhibition nachgewiesen. Der in dieser Arbeit nachgewiesene myelotoxische und antiproliferative Effekt des ATG ist im Rahmen der Therapie der MDS durchaus positiv zu werten. Fraglich ist jedoch, ob nicht die apoptoseinduzierende Wirkung des ATG eine schnelle hämatologische Remission bei der AA verhindert. Auf der Basis dieser Daten erscheint die Entwicklung von ATG-Präparationen mit unterschiedlichen Verhältnissen hinsichtlich immunsuppressiver Wirkung und direkt myelotoxischer/antiproliferativer Wirkung sinnvoll. Präparate mit hoher myelotoxischer/antiproliferativer Wirkung würden sich zur Prüfung bei den MDS anbieten, bei der AA jedoch Präparationen mit ausgeprägter immunsuppressiver Wirkung.

Antithymocyte globulin is the standard immunsuppressive therapy for aplastic anemia (AA) patients who are not eligible for allogenic bone marrow transplantation (BMT). Studies demonstrated a successful ATG treatment of a subset of patients with low risk myelodysplastic syndrome. The effective components of ATG and the exact mechanism of action for treatment of AA and MDS are still under investigation. In this work the effect of ATG on apoptosis and proliferation on haematopoietic cells was analysed. This work demonstrates induction of apoptosis in lymphoid and myeloid cell lines with various stages of differentiation and origin by ATG. Despite the different sensibility of the analysed cell lines, induction of apoptosis could be demonstrated at most cell lines with therapeutic ATG concentrations. Co-incubation of cells with ATG and etoposide or G-CSF or Cyclosporin A did not result in an altered proportion of apoptotic cells. In investigations on how far the CD95-system is involved in ATG-induced apoptosis no CD95-antibodies could be detected in the used ATG preparations with the applied methods. The treatment of cell lines with ATG had no regulatory effect on CD95-expression. Induction of CD95 did not increase ATG induced apoptosis and no inhibition of ATG induced apoptosis could be detected by blocking the CD95 pathway as well. Therefore, a role of the CD95-system as main mechanism in ATG induced apoptosis could be excluded. Moreover, ATG induced activity of caspases, especially of the caspase-3. Co- incubation of cells with ATG and the caspase inhibitor Z-DEVD-FMK showed no reduction of the portion of apoptotic cells. This could be due to caspase independent mechanisms of ATG induced apoptosis or due to insufficient blocking of all caspases involved in this process by Z-DEVD-FMK. Beside the effect of apoptosis induction, ATG led to an apoptosis independent inhibition of proliferation. The myelotoxic/antiproliferative effect of ATG shown in this work can be interpreted as a positive result for the therapy of MDS. But the question remains whether the apoptosis induction of ATG inhibits a fast hematological remission by AA. On the basis of this data the development of ATG preparations with different behaviour concerning immunsuppressive activity and direct myelotoxic/antiproliferative effects might be advisable. Preparations with high myelotoxic/antiproliferative effect should be proved for MDS, preparations with considerable immunsuppressive effect by AA, respectively.