Dekalzifikation von Zahnhartgewebe: eine vergleichende In-vitro-Untersuchung zum Einfluss von Ultraschall, Temperatur und Entkalkungsmedium auf die Dauer der Dekalzifikation unter Begutachtung der Qualität des histologischen Schnittpräparats

Abstract

Die Dekalzifikation (Entkalkung) von Zahnhartgewebe ist erforderlich, um die Schneidbarkeit im Rahmen der Herstellung histologischer Schnittpräparate für die lichtmikroskopische Untersuchung zu gewährleisten. Konventionell werden Zähne durch Einlegen in Säure bei Raumtemperatur entkalkt. Im Routinebetrieb stellt dieser Prozess jedoch ein nicht standardisiertes Verfahren ohne verlässliche Vorhersagbarkeit der Entkalkungsdauer dar. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Dauer der Dekalzifikation von Zähnen unterschiedlicher Beschaffenheit unter Verwendung verschiedener Entkalkungsmedien zu evaluieren und im Speziellen den Einfluss von Ultraschall unterschiedlicher Intensität und Temperatur variabler Höhe zu fokussieren. Ermittelt werden sollte die geringste Entkalkungsdauer unter qualitativer Beurteilung der Schnittpräparate. Im Rahmen der Versuche wurden 126 menschliche, kariesfreie und kariöse Zähne unterschiedlicher Zahntypen (Dentes incisivi, Dentes canini, Dentes sapientiae) untersucht. Die Zähne wurden in 21 Gruppen zu je 6 Proben aufgeteilt. Die Zahnproben der ersten Studiengruppe entkalkten konventionell bei Raumtemperatur durch Einlegen in 7%ige Salpetersäure, 50%ige Ameisensäure und Decal®-Lösung. Durch ein Ultraschallgerät wurden die Faktoren Ultraschall und Temperatur anschließend in die Versuche miteinbezogen: Die Dekalzifikation erfolgte unter Verwendung der genannten Medien bei Ultraschallleistungen von 90 W und 180 W und Entkalkungstemperaturen von 17° C, 24° C und 35° C. Die Dekalzifikation galt als beendet, wenn die Proben mit einem Skalpell teilbar waren (physikalische Prüfung), die ermittelte Entkalkungsdauer in Stunden wurde erfasst. Der geteilte Zahn wurde in Paraffin eingebettet, mit einem Mikrotom geschnitten und Hämatoxylin-Eosin gefärbt, eine lichtmikroskopische Beurteilung erfolgte im Anschluss. Mit zunehmender Ultraschallleistung des Ultraschallgerätes verringerte sich die Dauer der Dekalzifikation der Zähne; es bestanden signifikante Unterschiede zwischen einer Ultraschallleistung von 90 W und 180 W. Durch einen Anstieg der Temperatur konnte die Entkalkungsdauer verkürzt werden; dies belegten die signifikanten Unterschiede zwischen den Entkalkungstemperaturen 17 °C und 35 °C. Die Verwendung 7%iger Salpetersäure erzielte die geringste Entkalkungsdauer, gefolgt von Decal®-Lösung. Mit 50%iger Ameisensäure ergab sich eine signifikant verlängerte Dekalzifikationsdauer, bei konventionell mit Ameisensäure entkalkten Zähnen trat eine Mazeration ein. Der Vergleich kariesfreier und kariöser Probekörper und der verschiedenen Zahntypen zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich der Entkalkungsdauer. Nach Abschluss der Dekalzifikation konnten 120 Schnittpräparate angefertigt werden. Sie wiesen eine einheitliche Hämatoxylin-Eosin-Färbung auf, lichtmikroskopisch ließen sich Dentin- und Zementstrukturen nachweisen. 6 konventionell mit Ameisensäure entkalkte Zähne konnten nicht aufbereitet werden. Entscheidend für die Verringerung der Dekalzifikationsdauer ohne qualitative Beeinträchtigung des Präparats ist die Kombination der genannten Faktoren: Es empfiehlt sich eine Entkalkung unter Verwendung von Ultraschall hoher Leistung (180 W) bei einer Temperatur von 35 °C. 7%ige Salpetersäure und Decal®-Lösung sind als geeignete Entkalkungsmedien anzusehen.

Decalcification of the calcified tissues of teeth is necessary in order to prepare them for microscopic examination. A common decalcifying method includes immersing the teeth in acids at room temperature. This procedure usually leads to a variation in time required for decalcification, disallowing a standardisation of the process. The aim of the present study was to evaluate the time required for decalcification of teeth that show a variety of their type and structure and to compare the efficacy of different decalcifying agents. Furthermore the impact of ultrasound and temperature on accelarating the process was focussed in order to evaluate a fast teeth decalcification method. 126 human carious and non-carious teeth of different types (Dentes incisivi, Dentes canini, Dentes sapientiae) were divided into 21 groups of 6 teeth. The specimen of the first group were decalcified in 7% nitric acid, 50% formic acid and Decal®-solution at room temperature. In the following groups the influence of ultrasound and temperature was focussed, using an ultrasonic device: Teeth were immersed in the three agents and decalcified under the influence of ultrasonic power (90 W, 180 W) and different temperatures (17 °C, 24 °C, 25 °C). The end point of decalcification was determined by physical method, cutting the specimen with a scalpel. They were embedded in paraffin, sectioned by microtome, stained with haematoxylin-eosin and observed under the light microscope. It was observed that under the influence of ultrasound decalcificaton was accelerated; shown by the significant differences of the time required for decalcification between 90 W and 180 W. With an increase of the temperature decalcification was faster; proved by a significant difference between 17 °C and 35 °C. It was found that 7% nitric acid was the fastest decalcifying agent followed by Decal®-solution. The time required for decalcification was the longest using 50% formic acid, maceration was observed at room temperature. There was no significant difference related to the required time of decalcification between carious and non-carious specimen nor between the different types of teeth. 120 specimen were subjected to tissue processing and showed uniformity of staining and preservation of tissue morphology. 6 specimen that were decalcified with formic acid at room temperature could not be processed histologically. Accelerating the process of decalcification, the combination of ultrasound (180 W), high temperature (35 °C) and 7 % nitric acid or Decal®-solution can be considered as a fast decalcification method that does not affect the histologic specimen.