Entwicklung einer Multiplex-PCR zum Nachweis Enteropathogener Escherichia coli

Abstract

5 verschiedene Pathovare enteropathogener E.coli sind beschrieben: EHEC, EPEC, ETEC, EIEC und EaggEC. Die unterschiedlichen klinischen Bilder beruhen auf einer differierenden Ausstattung der Pathovare mit Virulenzfaktoren. Serotyping ist nutzlos für die Diagnostik, und Methoden auf DNA- Ebene müssen entwickelt werden. Da die Diagnostik in Deutschland im wesentlichen serologisch durchgeführt wird, gibt es noch keine validen Prävalenzen. Wir entwickelten ein Multiplex- PCR- Panel, um mindestens 1 Virulenzfaktor für jeden Pathovar nachzuweisen, zuzüglich einer Positivkontrolle zum Erkennen von Inhibition der PCR. Die Pathovare wurden direkt aus Stuhlproben bzw. Rektalabstrichen nachgewiesen. Der Einsatz in der Routine- Diagnostik wurde anschließend anhand von 225 Proben von Kindern und Reiserückkehrern getestet. In 13 Proben trat Inhibition auf. In 19.3% aller Proben wurden Pathovare enteropathogener E.coli nachgewiesen. Reiserückkehrer waren dabei mit 26.2% häufiger betroffen als Kinder mit 21.6%. EaggEC war der dominierende Pathovar mit einem Anteil von 47.6% an allen positiven Proben (bei Kindern 59,7%, bei Reiserückkehrern 43.8%), gefolgt von EIEC mit 28.3% und ETEC mit 15.2%. Nur in einer Minderheit der positiven Proben fanden sich EHEC (6.5%) und EPEC (2.2%). Unsere Studie zeigt, daß enteropathogene E.coli ein wichtiger Auslöser von Durchfällen in Deutschland sind. EaggEC spielen eine weit größere Rolle als bisher angenommen. Wir etablierten eine Methode zum simultanen Nachweis der 5 Pathovare von E.coli auf DNA- Ebene und schlossen die diagnostische Lücke hinsichtlich des Nachweises der EaggEC. Die Multiplex- PCR bewies sich als schnelle, kostengünstige, höchst sensitive und höchst spezifische Methode und somit als sinnvolle Ergänzung der mikrobiologischen Diagnostik.

5 different pathovars of enteropathogenic E.coli are mainly described: EHEC, EPEC, ETEC, EIEC and EaggEC, which lead to differing clinical pictures. This diversity depends on factors of virulence harbored by strains of E.coli. Detecting the diferent pathovars with serotyping is useless, and diagnostic methods on DNA level have to be improved. Since detection of of enteropathogenic E.coli in germany still is performed by serological methods, their prevalences remain to be recorded properly. We established a multiplex- PCR-panel for detection of at least one factor of virulence for each pathovar, additional a positiv control to detect inhibition in PCR. The pathovars were detected directly from stool of infants and travelers. 13 samples showed inhibition. In 19.3% of all samples pathovars of enteropathogenic E.coli were detected, being of higher prevalence in travelers (26.2%) compared to children (21.6%). EaggEC was predominant pathovar with 47.6% of all positiv samples (children 59.7%, travelers 43.8%), followed by EIEC with 28.3% and ETEC with 15.2%. Only in a minority of positiv samples EHEC (6,5%)and EPEC (2.2%) were found. Our study shows enteropathogenic E.coli being important agents for diarrhea in germany. EaggEC play a bigger part than what was assumed before. We established a method for the simultaneous proof of the 5 pathovars of E.coli on DNA-level and closed the diagnostic gap in detection of EaggEC. This multiplex-PCR has prooved to be a rapid, inexpensiv, highly sensitiv and highly specific method and is a useful completion in microbiologic diagnostic.