Investigation of the antiproliferative mechanisms of the chemopreventive agent ursodeoxycholic acid (UDCA) in vitro

Abstract

Introduction: Colorectal cancer is the second most common cancer and the third most common cause of cancer death in the western world. Ursodeoxycholic acid (UDCA), a bile acid used in the treatment of primary biliary cirrhosis, has been shown to prevent colon cancer in animal models. The mechanism of the chemopreventive action of UDCA is not understood. Objectives: The objective of this project was to investigate the antiproliferative mechanisms of UDCA. Materials and Methods: Four established p53wt human carcinoma cell lines were treated with UDCA (0-400 µM) for 3 days and proliferation was investigated by cell count, MTT test and BrdU incorporation. Apoptosis was determined by DAPI staining and detection of PARP cleavage by western blot. Senescence was determined by β-galactosidase staining. The cell cycle was studied by FACS using nocodazole-synchronized or non-synchronized cells. Expression of c-Myc and other cell cycle markers were analysed by western blot. Effect of UDCA on PCNA binding to chromatine was detected by inmunohistochemistry and E2F-1 transcriptional activity was investigated by luciferase reporter assay. c-Myc was suppressed by transfection by pSuper-c-Myc plasmid. Overexpression of c-Myc was induced by transient transfection of pCMV-c-Myc plasmid. Transcriptional regulation of c-Myc was investigated by luciferase reporter assay and OneStep RT-PCR. The influence on the wnt pathway was tested in an isogenic pair of wnt-proficient and wnt-deficient cell lines. Results: UDCA inhibited the growth of colon cancer cells in a partially reversible manner, the extent of inhibition was independent from the speed of growth of the cell line. UDCA did not induce apoptosis and induced senescence only in LS513 cells. S-phase population was decreased after treatment in all cell lines investigated, in HCT116 and HCT8 cells UDCA slowed down the cell cycle and induced G1-->S transition delay, and in LS513 it induced increase in G2/M population and S-phase arrest. UDCA treatment downregulated c-Myc, cyclin A, CDK2, CDK6 and Rb, upregulated p21 and induced Rb hypophosporylation. UDCA decreased E2F-1 transcriptional activity and inhibited PCNA binding to chromatine. The G1-->S transition delay by UDCA was concomitant with effect on c-Myc, p21, and cyclin A expression and Rb phosphorylation. c-Myc suppression was sufficient to inhibit proliferation, induce p21 upregulation, CDK2 and CDK6 downregulation and Rb hypophosphorylation. c-Myc downregulation was not transcriptional and it was concomitant with increase in phosphorylation at threonine 58 and a persistant ERK phosphorylation. Cells overexpressing c-Myc did not proliferate and the wnt pathway deficiency did not affect the inhibition of proliferation by UDCA. Conclusion: UDCA decreased the proliferation of colon cancer cells by delaying the G1-->S transition and slowing down the cell cycle. Suppression of c-Myc contributed to the inhibition of proliferation. Together with p21 overexpression, Rb hypophosphorylation and cyclin A downregulation, it could play a role in the delay of the G1-->S transition and inhibition of proliferation.

Einleitung: Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Krebserkrankung und die dritthäufigste Krebstodesursache in der westlichen Welt. Es wurde gezeigt, dass, Ursodeoxycholsäure (UDCA), eine Gallensäure die zur Behandlung der primär biliären Zirrhose verwendet wird, die Entstehung des Kolonkarzinoms im Tiermodell und der chronischen Entzündung verhindert. Der Mechanismus der chemopräventiven Wirkung von UDCA ist noch nicht verstanden. Ziele: Das Ziel dieses Projektes war es, die antiproliferativen Mechanismen von UDCA zu untersuchen. Material und Methodik: Vier etablierte humane p53wt Kolonkarzinom-Zelllinien wurden mit UDCA (0-400 µM) für 3 Tage behandelt und die Proliferation wurde durch Zellzählung, MTT-Test und Bromodesoxyuridin (BrdU)-Einbau untersucht. Apoptose wurde durch DAPI-Färbung und Detektion von PARP-Spaltung mittels Western Blot bestimmt. Seneszenz wurde durch β -Galaktosidase-Färbung bestimmt. Der Zellzyklus von Nocodazol-synchronisierten oder nicht-synchronisierten Zellen wurde mittels FACS untersucht. Die Expression von c-Myc und anderen Zellzyklus-Markern wurde mittels Western Blot analysiert. Die Wirkung von UDCA auf PCNA-Bindung an Chromatin wurde mittels Immunhistochemie untersucht, und der E2F-1 transkriptionelle Aktivität wurde mit Hilfe von Luciferase-Reportersonden ermittelt. c-Myc Expression wurde durch Transfektion mit einem pSuper-c-Myc Plasmid unterdrückt. Die Überexpression von c-Myc wurde durch Transfektion mit pCMV-c-Myc Plasmid induziert. Die Transkriptionelle Regulation von c-Myc wurde mit Luciferase- Reportersonden und OneStep RT-PCR untersucht. Der Einfluss auf den Wnt- Signalweg wurde in einem isogenen Paar Wnt-kompetenter und Wnt-defizienter Zelllinien getestet. Ergebnisse: UDCA hemmte das Wachstum von Kolonkarzinomzellen teilweise reversibel. Das Ausmaß der Hemmung war von der Geschwindigkeit des Wachstums der Zelllinie unabhängig. UDCA induzierte keine Apoptose und Seneszenz wurde nur in LS513 Zellen induziert. Der S-Phase Anteil war nach der Behandlung in allen Zelllinien reduziert. UDCA verlangsamte in HCT116 und HCT8 Zellen den Zellzyklus und verzögerte den G1--> S Übergang. Sie erhöhte in LS513 Zellen den G2/M Anteil und induzierte einen S-Phasen Arrest. UDCA Behandlung reduzierte die c-Myc, Cyclin A, CDK2, CDK6 und Rb Expression, erhöhte die p21 Expression und induzierte Rb Hypophosporylierung. UDCA inhibierte die transkriptionelle Aktivität von E2F-1 und die Bindung von PCNA an Chromatin. Die Verzögerung des G1 --> S Übergangs durch UDCA war gleichzeitig mit der Veränderung der Expression von c-Myc, p21 und Cyclin A und mit der Rb Hypophosphorylierung verbunden. Die c-Myc Supression war ausreichend, um die Zellproliferation zu hemmen, die Expression von p21 zu erhöhen, die CDK2 und CDK6 zu erniedrigen und die Rb Hypophosphorylierung zu inhibieren. c-Myc wurde auf transkriptionellen Ebene nicht reguliert. Das geschah zeitgleich mit der Zunahme der Phosphorylierung an Threonin 58 und einer anhaltenden ERK-Phosphorylierung. Zellen in denen c-Myc Überexprimiert war proliferierten nicht und das Fehlen des Wnt-Signalwegs hatte keinen Einfluss auf die Hemmung der Proliferation durch UDCA. Fazit: UDCA verringert die Proliferation von Kolonkarzinomzellen durch Verzögerung des G1 --> S Übergangs und eine Verlangsamung des Zellzyklus. Die Unterdrückung von c-Myc trägt zur Hemmung der Proliferation bei. Zusammen mit der p21 Überexpression, der Rb Hypophosphorylierung und der Cyclin A Supression, könnte dies verantwortlich für die Verzögerung des G1 --> S Übergangs und die Hemmung der Proliferation sein.