The mechanism of sensitivity and resistance of melanoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)

Abstract

New therapeutic strategies are urgently needed to improve the dismal prognosis of malignant melanoma. In this study, the expression and functionality of DR4 and DR5 in melanoma cell lines in vitro as well as their significance for the in vivo situation was investigated. Mechanisms of TRAIL-resistance have been addressed by investigation of TRAIL-induced NF-kappaB activation and by establishing a cell culture model for TRAIL-resistance. In this study, DR5 was found consistently expressed in all melanoma cell lines, whereas DR4 expression was found only in 2/7 cell lines. High sensitivity to TRAIL-induced apoptosis was characteristic for DR4-positive melanoma cells, whereas DR4-negative cell lines showed less and delayed response or were completely resistant. Employment of selective DR4/DR5 blocking antibodies unequivocally proved the prevalent role of DR4 in the melanoma cell lines, where it was expressed. The significance of these data for the in vivo situation was finally evaluated by immunohistochemistry, which proved for the first time pronounced expression of DR4 as well as of DR5 in melanoma primary tumors. High TRAIL-induced activation of NF-kappaB was seen only in apoptosis sensitive melanoma cell lines expressing DR4, whereas TRAIL failed to activate NF-kappaB in DR4-negative (DR5-positive) melanoma cells regardless their sensitivity. Activation of NF-kappaB by TRAIL was not associated with any changes in the expression of the antiapoptotic proteins as c-FLIP, Bcl-xL, XIAP, Survivin or Livin. Rather, TRAIL induced downregulation of DR4 in one of the cell lines, and this effect was prevented by proteasome inhibition (LLnL). In general, LLnL increased TRAIL sensitivity in melanoma cell lines was independent from NF-kappaB activation. Also in selected, TRAIL-resistant melanoma cells, neither an increase in TRAIL-induced NF-kappaB activation nor an increased expression of antiapoptotic proteins was found. Unraveling the mechanism of TRAIL resistance in melanoma cell lines, significant downregulation of the expression of caspase-8, caspase-10 and of DR4 but not of DR5 was found in selected, TRAIL-resistant melanoma cells. Sensitivity of selected, TRAIL-resistant melanoma cells was largely retained after exogeneous overexpression of initiator caspases and of DR4. Thus, high efficiency of DR4-mediated apoptosis in vitro and frequent DR4 expression in vivo may suggest reassessment of the suitability of TRAIL and especially of DR4-based strategies for melanoma treatment. Resistance to TRAIL-induced apoptosis in melanoma cells may be based on downregulation of initiator caspases and of DR4 but seems to be unrelated to NF-kappaB-driven upregulation of antiapoptotic factors.

Neue therapeutische Strategien werden daher benötigt, um die schlechte Prognose des malignen Melanoms zu verbessern. In dieser Untersuchung wurde sowohl die Expression der Todesrezeptoren DR4 und DR5 in vitro, ihre Funktionalität als auch ihre Expression in Melanomzelllinien in vivo nachgewiesen. Mögliche Mechanismen der TRAIL-Resistenz wurden mit der Untersuchung von TRAIL-induziertem NF-kappaB (nuclear factor-kappaB) als auch mit der Etablierung Zell- Kulturmodels der TRAIL-Resistenz durchgeführt. In den Untersuchungen zeigte sich eine durchgehende Expression von DR5, wohingegen DR4 nur bei 2/7 Zelllinien gefunden wurde. Starke Sensitivität gegen TRAIL zeigte sich insbesondere bei DR4-positiven Melanomzelllinien, während DR4-negativen Zellen geringere und verzögerte Apoptose zeigten oder komplett resistent waren. Die Verwendung von spezifischen, blockierenden DR4/DR5-Antikörpern belegte die dominierende Rolle von DR4 bei Melanomzelllinien in eindeutiger Weise. Die Signifikanz dieser Daten für die in vivo Situation wurde mittels immunhistochemischer Untersuchungen untermauert, und damit wurde zum ersten Male die Bedeutung der Expression von DR4 und DR5 in primären Tumoren gezeigt. Bei Apoptose-sensitiven Zelllinien mit DR4-Expression wurde eine hohe TRAIL-induzierte NF-kappaB Aktivität gefunden, während sich in DR4-negativen Melanomzelllinien keine durch TRAIL- induzierte NF-kappaB Aktivität fand, unabhängig von ihrer Sensitivität. Die erhöhte NF-kappaB Aktivität in DR4-positiven Zellen führte jedoch zu keiner signifikanten Veränderung in der Expression von anti-apoptotischen Proteinen wie c-FLIP, Bcl-xL, XIAP, Survivin und Livin. Stattdessen bewirkte die TRAIL- Stimulation eine Reduzierung der DR4-Expression in einer der Zelllinien. Diese Wirkung von TRAIL konnte durch den Proteasomen-Inhibitor (LLnL) verhindert werden. In der Regel führte LLnL zu einer erhöhten TRAIL-Sensitivität bei Melanomzelllinien, unabhängig von einer TRAIL-induzierten NF-kappaB Aktivität. In selektierten TRAIL-resistenten Melanomzelllinien zeigte sich weder ein Anstieg der NF-kappaB Aktivität noch eine Veränderung der Expression von antiapoptotischen Proteinen. In diesen Melanomzelllinien fand sich eine signifikante Herabregulation der Expression von proapoptotischen Proteinen wie Caspase-8, Caspase-10 und DR4 aber nicht von DR5. Die Bedeutung dieser proapoptotischen Faktoren zeigte sich nach Exogener Überexpression von Initiator-Caspasen und von DR4, wodurch die Sensitivität von selektierten Melanomzelllinien teilweise zurückgewonnen werden konnte. Aufgrund der hohen DR4-induzierten Apoptose in vitro und starken DR4 Expression in vivo in Melanomzelllinien sollte die Anwendbarkeit von TRAIL und besonders von DR4-basierten Strategien für die Behandlung des malignen Melanom neu beurteilt werden. Die Resistenz gegen TRAIL-induzierte Apoptose in Melanomzelllinien hängt unter anderem von der Herabregulation der Initiator-Caspasen und von DR4 in Melanomzelllinien ab. Antiapoptotischen Proteine, die von TRAIL-induziertem NF-kappaB reguliert werden könnten, besitzen dahingegen eher keine Relevanz.