Die Etablierung von APC-Zelllinien zur Identifikation potentieller Autoantigene von CD8+ T-Zellen bei Autoimmunerkrankungen am Beispiel der Psoriasis vulgaris

Abstract

Die Psoriasis ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der Haut, Nägel und Gelenke, deren genaue Pathogenese noch unverstanden ist. In der letzten Zeit wird in der Psoriasis vulgaris insbesondere den CD8+ T-Zellen eine Schlüsselrolle bei der Erkennung von Autoantigenen wie z.B. Zytokeratinen (KRT17) zugeschrieben. Allerdings gibt es bisher keine valide Methode, um eine antigenspezifische Aktivierung der CD8+ T-Zellen von Psoriasis-Patienten durch bereits identifizierte und kontrovers diskutierte potentielle Autoantigene (z.B. KRT13) einheitlich zu testen, miteinander zu vergleichen und näher zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit hatte das übergeordnete Ziel, ein auf einer humanen antigenpräsentierenden (APC-) Zelllinie basierendes experimentelles in-vitro Testsystem für potentielle Autoantigene von CD8+ T-Zellen in der Psoriasis vulgaris zu entwickeln. Dazu wurden jeweils zwei potentielle Autoantigene der Psoriasis (KRT17 und KRT13) und ein Kontroll- Antigen (Cytomegalievirus-CMV-Antigen pp65) in das piggyBacTm–Transposon Expressionsvektorsystem kloniert und durch Elektroporation in die humane HLA-A2+ APC Zelllinie T1 transfiziert. Zur Kontrolle der Expression wurde der piggyBacTm-Expressionsvektor pPB-eGFP-mCherry etabliert und ebenfalls in die Zelllinie T1 transfiziert. Nach vier durchflusszytometrischen Sortierungsschritten über die Reporter eGFP bzw. mCherry konnten die stabil- transfizierten T1 Zelllinien T1-MCS-eGFP, T1-pp65-eGFP, T1-KRT17-eGFP, T1-KRT13-eGFP und T1-eGFP-mCherry etabliert werden. In den Etablierungsexperimenten reagierten die T-Zellen von sechs getesteten HLA-A2 +/CMV-sero-positiven Probanden neben einer generalisierten Aktivierung insbesondere mit einer signifikant höheren Expression von CD8+ CD25+ CD137+ (hoch positiv) T-Zellen nach Stimulation mit T1-pp65-eGFP verglichen zur Stimulation mit den Referenzzelllinien T1-MCS-eGFP bzw. T1. Auf dieser Grundlage wurde die CD8+ T-Zell-Reaktion von acht HLA-A2+ Psoriasis-Patienten und sechs HLA-A2+ gesunden Kontroll-Probanden auf die Zelllinien T1-KRT17-eGFP und T1-KRT13-eGFP untersucht. Während bei nur einem gesunden Probanden die CD8+ T-Zellen mit einer deutlich höhren Expression von CD8+ CD25+ CD137+ T-Zellen auf T1-KRT13-eGFP im Vergleich zu T1-MCS-eGFP reagierten, zeigten die CD8+ T-Zellen der Psoriasis-Patienten individuell unterschiedlich hohe Expressionen von CD8+ CD125+ CD137+ T-Zellen auf T1-KRT17-eGFP und/oder T1-KRT13-eGFP. In Relation zur ausgelösten Aktivierung durch T1-MCS-eGFP wurden die CD8+ T-Zellen der Psoriasis-Patienten tendentiell stärker durch T1-KRT17-eGFP bzw. T1-KRT13-eGFP aktiviert als die der gesunden Kontroll- Probanden. In dieser Arbeit konnte neben alloreaktiven T-Zellen insbesondere durch die Messung der Expression von CD8+ CD25+ CD137+ (hoch positiv) T-Zellen die Häufigkeit derjenigen CD8+ T-Zellen identifiziert werden, die antigenspezifisch auf eine mit einem Antigen bzw. Autoantigen stabil- transfizierte T1 Zelllinie reagierten. Weiterhin konnte bei einigen Psoriasis- Patienten eine Aktivierung von CD8+ T-Zellen durch KRT17 bzw. KRT13 aufgezeigt werden. Schlussendlich bietet das etablierte Testsystem neben der Untersuchung von anderen potentiellen Autoantigenen zugleich eine Grundlage, um weitere Analysen an den antigenspezifisch aktivierten CD8+ T-Zellen vorzunehmen.

Psoriasis is a common chronic inflammatory skin disease, that can also affect the nails and joints. Although the pathogenesis of psoriasis vulgaris remains not fully understood, several studies recently suggested a critical role for CD8+ T cells reacting with autoantigens e.g. keratins (KRT17). However, there is a valid method missing in order to investigate an antigen-specific activation of CD8+ T cells through controversally discussed potential autoantigens (i.e. KRT13). The main aim of this study was to establish an in vitro test system for potential autoantigens of CD8+ T cells in psoriasis vulgaris, which is based on a human antigen presenting cell line (APC). Therefore, two potential autoantigens (KRT17, KRT13) and a control antigen (Cytomegalovirus-CMV-antigen pp65) were cloned into the piggyBacTm-Transposon expression vector system and transfected into the HLA-A2+ human APC T1 by using electroporation. The piggyBacTm- expression vector pPB-eGFP-mCherry was created for expression control and also transfected into T1. After four cell sorting steps by flow cytometry on the basis of the reporters eGFP/ mCherry, the stably transfected T1 cell lines T1-MCS-eGFP, T1-pp65-eGFP, T1-KRT17-eGFP, T1-KRT13-eGFP and T1-eGFP-mCherry could be established. Depsite of a general activation induced by the T1 cell lines, the T cells of 6 HLA-A2+ CMV- sero- positive donors showed significantly higher frequencies of CD8+ CD25+ CD137high+ cells in reaction to T1-pp65-eGFP compared to the reference cell lines T1-MCS-eGFP or T1. Due to these results, the activation of CD8+ T cells from 8 HLA-A2+ psoriatis patients and 6 HLA-A2+ healthy controls through T1-KRT17-eGFP and T1-KRT13-eGFP were examined. In contrast to one healthy control donor, whose T cells obviously responded with a higher expression of CD8+ CD25+ CD137high+ cells to T1-KRT13-eGFP, the CD8+ T cells of psoriasis patients showed variable frequencies of CD8+ CD25+ CD137high+ cells to T1-KRT17-eGFP or T1-KRT13-eGFP compared to T1-MCS-eGFP. There is a trend, that the CD8+ T cells of the psoriasis patients became higher activated through T1-KRT17-eGFP and T1-KRT13-eGFP in relation to T1-MCS-eGFP than the CD8+ T cells of healthy controls. This study could demonstrate beside alloreactive T cells an antigenspecific response of CD8+ T cells to with (auto)antigens stably transfected T1 cell lines by analysing the expression of CD8+ CD25+ CD137high+ T cells. Furthermore the potential of KRT17 to activate CD8+ T-cells of psoriasis patients could be confirmed and even demonstrated for KRT13. Finally, the established test system provides beside the investigation of other potential autoantigens attractive options to make further analysis on antigenspecific activated CD8+ T cells.