Charakterisierung und Differenzierung von humanpathogenen Mikoorganismen mittels schwingungsspektroskopischer Techniken

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Zielsetzungen verfolgt. Zum einen wurden verschiedene schwingungsspektroskopische Techniken, wie die FTIR- Spektroskopie, die FT-RAMAN-Spektroskopie und die FTIR-Mikroskopie hinsichtlich ihrer Einsetzbarkeit zur Charakterisierung und Differenzierung von humanpathogenen Mikroorganismen vergleichend untersucht und bewertet. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Möglichkeit, ein neues Antibiotikaempfindlichkeitsverfahren auf Basis von schwingungsspektroskopischen Techniken zu realisieren. Schwingungsspektroskopischen Techniken ermöglichen es, Untersuchungen an intakten mikrobiellen Zellen durchzuführen, ohne diese dabei zu zerstören. Dabei liefern die erhaltenen Spektren einen komplexen biochemischen Fingerabdruck aller zellulären Bestandteile. Weitere Vorteile der Techniken liegen in der Schnelligkeit und einfachen Durchführbarkeit bezüglich der Probenpräparation, die ohne jegliche Agenzien wie z. B. Farbstoffindikatoren auskommt. Diese Eigenschaften prädestinieren schwingungsspektroskopische Methoden für das Gebiet der Mikrobiologie, insbesondere der klinischen Routinediagnostik. Hier werden überwiegend phänotypische Techniken eingesetzt, die zumeist nur einen oder einige wenige Zellbestandteile (z. B. ein bestimmtes Enzym) detektieren können und, da sie zumeist nur mit größeren Mengen einer Reinkultur durchgeführt werden können, zeit-und arbeitsintensiv sind. Ent Spezies zählen zu den zweithäufigsten Verursachern von Nosokomialinfektionen, so dass ihnen eine besondere klinische Signifikanz zukommt. Aus diesem Grund wurde ein Datensatz bestehend aus sieben verschiedenen Enterococcus Spezies ausgewählt, an dem gezeigt werden konnte, dass sowohl die FTIR-Spektroskopie, als auch die FT-RAMAN-Spektroskopie eine potenzielle Alternative zu den konventionellen Techniken darstellen. Mittels beider Techniken konnte eine korrekte Klassifizierung auf Speziesebene erhalten werden, die weder mit dem konventionellen API- noch dem MICROSCAN- System erreicht wurde. Darüber hinaus stimmten nur die Klassifizierungsergebnisse der FTIR- und der RAMAN-Spektroskopie, die auf einer hierarchischen Clusteranalyse basierten, mit den Ergebnissen der 16S- RNA-Sequenzierung, dem �Goldstandard� für die mikrobielle Analyse, überein. Durch eine spezifische Wellenlängenselektion, bei der die sehr intensiven Banden des in zwei Enterococcus Stämmen exprimierten Pigments Carotinoid aus der Clusteranalyse der RAMAN-Spektren ausgeschlossen wurden, konnten nahezu identische Klassifikationsschemata für beide schwingungsspektroskopische Techniken erhalten werden. Beide Techniken zeichnen sich zudem auch durch eine hohe Reproduzierbarkeit aus, wie an stammspezifischen Subclustern bestehend aus unabhängigen Wiederholungskulturen, deutlich wurde. Um diese Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, müssen standardisierte Wachstumsbedingungen und Propenpräparationen eingehalten werden. Das hohe Differenzierungspotenzial dieser Techniken beschränkt sich jedoch nicht nur auf Bakterien, sondern kann auch auf Hefen angewandt werden, wie anhand einer FTIR-spektroskopischen Studie an sieben verschiedenen Spezies der Gattung Candida gezeigt werden konnte. Es konnte eine eindeutige Differenzierung auf Speziesebene für die Gattung Candida erreicht werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass mikrospektrometrische Messungen an Mikrokolonien (50 bis 80 µm) durch die Erarbeitung einer ortsgetreuen Replikatechnik Spektren liefern, die reproduzierbar sind und ein genügend hohes Signal/Rausch- Verhältnis aufweisen. Die Vorteile dieser Methodik liegen vor allem in ihrer Schnelligkeit und einfachen Probenpräparation, da die Mikrokolonien in Abhängigkeit vom Organismus nach nur 6 bis 8 h auf optische Materialien übertragen und anschließend ohne weitere präparative Schritte gemessen werden können. Das hohe Potenzial der FTIR-Mikrospektrometrie im Hinblick auf Zeitbedarf und Präzision zur Identifizierung von Mikroorganismen konnte im Rahmen einer klinischen Studie, die an Blutkulturen durchgeführt wurde, unter Beweis gestellt werden. Es konnte eine korrekte Identifizierung von 98,3% der untersuchten Proben erreicht werden. Dieses sehr gute Identifizierungsergebnis ist auch in wesentlichen Teilen auf das Auswerteverfahren zurückzuführen, das auf einem Identifizierungsmodell unter Anwendung von hierarchisch organisierten neuronalen Netzen basierte. Im zweiten Teil der Arbeit, der die Entwicklung eines spektroskopischen Antibiotikaempfindlichkeitstests beinhaltete, wurde zunächst die Möglichkeit geprüft, ob die in den FTIR- Spektren der Zellen enthaltenen spektralen Informationen spezifisch genug sind, um sensitive von resistenten Stämmen differenzieren zu können. Hierzu wurden gezielt Mikroorganismen mit spezifischen Antibiotikaresistenzen untersucht. Dabei handelte es sich um epidemiologisch repräsentative Datensätze von Vancomycin-resistenten/Vancomycin-sensitiven Enterococcus (VRE/VSE) Stämmen und von Methicillin-resistenten/Methicillin-sensitiven S. aureus (MRSA/MSSA) Stämmen. VRE und MRSA unterscheiden sich dabei in mehreren Aspekten, die sich auch in den Spektren widerspiegeln. Die durch das VanA-Gen vermittelte Vancomycinresistenz bei den hier untersuchten VRE-Stämmen wird durch Glykopeptidantibiotika induziert, während die mecA-Gen vermittelte beta- Lactamresistenz konstitutiv vorliegt. Diese unterschiedlichen Mechanismen, die die Expression des jeweiligen Resistenzgens auslösen, sind dafür verantwortlich, dass für die beiden VRE/VSE-Datensätze keine Differenzierung zwischen sensitiven und resistenten Stämmen auf Basis ihrer Spektren per se erzielt werden konnte. Von den drei MRSA/MSSA-Datensätzen konnte jedoch trotz der konstitutiv vorliegenden beta-Lactamresistenz auch nur bei einem Datensatz mittels Clusteranalyse eine Diskriminierung in resistente und sensitive Stämme erfolgen. Dieser Datensatz enthielt überwiegend hoch resistente MRSA-Stämme, bei denen der Resistenzphänotyp stärker ausgeprägt ist. Die Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen führte bei beiden Spezies zu keiner signifikant verbesserten Klassifizierung, da die gesamten Datensätze sowohl der MRSA/MSSA- Stämme als auch der VRE/VSE-Stämme genotypisch relativ heterogen waren, so dass die dadurch bedingten großen stammspezifischen Varianzen das weniger stark ausgeprägt Resistenz- bzw. Sensitivitätsverhalten überdeckten. Aufgrund dieser nur sehr eingeschränkt möglichen Differenzierbarkeit zwischen sensitiven und resistenten Zellen auf Basis ihrer Spektren per se wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neues Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung von Antibiotika mit mikrobiellen Zellen basierend auf mikrospektrometrischen Messungen entwickelt. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnte zum ersten Mal der Einfluss eines typischen beta-Lactams auf resistente und sensitive Zellen untersucht werden, die als Mikrokolonien auf festem Nährmedium kultiviert wurden. Hierdurch gelang zum einen die eindeutige Differenzierung zwischen resistenten und sensitiven Zellen und zum anderen konnte die Wirkungsweise des hierbei verwendeten beta-Lactamantibiotikums mit den in den Spektren gefundenen Veränderungen korreliert werden.

In this thesis, two objectives were addressed. First, different vibrational spectrocopic techniques, such as FTIR spectroscopy, FT-RAMAN spectroscopy and FTIR microspectroscopy were investigated in comparison with respect to their applicability for the characterization and differentiation of pathogenic microorganisms. The second part of the work was focused on the development and evaluation of a new method based on infrared spectroscopy to test the antibiotic susceptibility behavior of microorganisms. Vibrational spectroscopic techniques allow the investigation of intact microbial cells in a non-destructive manner and produce complex, biochemical-like fingerprint spectra providing information about all cellular components. These techniques are rapid, because little biomass is needed significantly reducing culturing time. Further advantages are ease of use, since they require virtually no sample handling and, apart from the culture medium, no consumables, such as labels or dyes. Therefore, vibrational spectroscopies have a great potential in the field of microbiology, especially in clinical diagnostic microbiology. Most clinical microbiological laboratories rely on phenotypical methods, which can detect one or a few cellular compounds only per test, e.g. one specific enzyme. Performing these tests is often laborious and time-consuming, since a substantial amount of time is accounted for the initial culturing steps, in order to obtain enough biomass to perform the test. Based on the results obtained from a collection of seven different Enterococcus species, which have emerged as one of the leading causes of nosocomial infections worldwide, it could be demonstrated that both methods, FTIR and RAMAN spectroscopy provide a potential alternative to conventional typing methods. Both spectroscopic techniques proved to be capable of discriminating accurately at the species level while the routinely used phenotypic identification systems (API, MICROSCAN) performed poorly. Moreover, the species classification based on the spectroscopic data, was consistent only with the results obtained by the 16S RNA sequencing, which is the �gold standard� for microbial identification. Comparison of FTIR and RAMAN clustering, based on a specific wavelength selection discarding the signal contributions of carotenoids, showed that there was considerable consistency between both methods, since very similar classification schemes were obtained. Additionally, replicate cultures of all strains were grouped in strain specific subclusters illustrating the excellent reproducibility of both methods. Standardization of culturing conditions and sampling preparations are prerequisites to obtain such highly reproducible classification results. The results of a FTIR spectroscopic study obtained from a collection of seven different Candida species proved that the high differentiation capacity of the IR technique is not restricted to the analysis of bacteria, but can be also applied to yeasts. A clear classification at the species level could be achieved for the genus Candida. By using FTIR microspectroscopy to measure microbial microcolonies, it was demonstrated, that high quality IR-spectra can be obtained by applying a special replica technique. This technique enables to transfer microcolonies growing on solid culture plates spatially accurate to an IR-transparent sample holder. The spectra recorded from such microcolonies (50 to 80 µm) were reproducible and of a sufficient signal to noise ratio. The most obvious advantage of this technique was the short time required for obtaining microcolonies, which already develop after only 6 to 8 h depending on the organism. By using this microspectroscopic technique to measure microcolonies as replicas there are minimal sample preparation steps prior to spectral acquisition enabling a rapid microbial identification method. The high potential of the microspectroscopic approach with respect to speed and precision for microbial identification was shown, based on a clinical study. In the course of this study, blood cultures were analyzed by FTIR microspectroscopy, parallel to the routine diagnostic microbiological analysis. High identification accuracy was achieved with 98,3 % of the microorganisms being correctly identified. The high identification accuracy can be ascribed to a large extent to the excellent identification model, based on a hierarchical organized neural network. The second part of the work focused on the development of a new antibiotic susceptibility test based on infrared spectroscopy. The aim of this study was to examine if the spectral information contained in the IR spectra of microorganisms are sufficient to discriminate sensitive from resistant cells. For this purpose microorganisms with specific antibiotic resistances were investigated. Representative datasets comprising Vancomycin resistant/Vancomycin sensitve Enterococcus (VRE/VSE) and Methicillin resistant/Methicillin sensitive S. aureus (MRSA/MSSA) strains were used to examine whether the resistant and sensitive strains can be differentiated on the basis of their spectra per se. There are several differences between VRE and MRSA, which are reflected by their infrared spectra. The Vancomycin resistance in E. faecium, which is encoded by the VanA gene, was investigated, since the resistance mechanism is induced only in the presence of glycopeptide antibiotics. Contrary, the beta-lactam resistance in MRSA, encoded by the mecA gene, is constitutively present. These differences in the resistance mechanisms, which trigger the expression of the respective resistance gene, might be the reason that no differentiation between resistant and sensitive strains on the basis of their spectra per se could be achieved for the two VRE/VSE data sets. However, despite the constitutive beta-lactam resistance, only one of the MRSA/MSSA datasets could be discriminated by means of hierarchical clustering according to resistant and sensitive strains. This dataset consisted in contrast to the other two datasets, mainly of high resistant MRSA strains, indicating that the resistance phenotype is much more pronounced. The classification results for both species could not be significantly improved by using artificial neural networks because of the greater genotypic heterogeneity of the total datasets of both species. The prevalence of the strain variance that presumably masks the less significant variance arising from the antibiotic susceptibility may account for the poor classification result obtained even with supervised classifiers such as ANNs. Based on these results indicating that the possibility to discriminate between sensitive and resistant cells on the basis of their spectra per se is very limited, a new method for rapid drug susceptibility testing based on the microspectroscopic technique was developed. The aim of this pilot study was to investigate for the first time the molecular effect of a typical beta-lactam antibiotic on the infrared spectra of sensitive and resistant S. aureus strains (MSSA,MRSA) growing as microcolonies on solid agar plates. Based on the results of this microspectroscopic approach, a clear differentiation between resistant and sensitive cells could be achieved and in addition, the mode of action of the beta-lactam antibiotic could be correlated to the changes that occurred in the spectra upon influence of the antibiotic.