Direct regulation of the interferon signaling pathway by the bromodomain containing protein 4

Abstract

The cellular bromodomain protein 4 (Brd4) is a transcriptional regulator. It binds to transcription factors, the positive transcriptional elongation complex and acetylated histone residues. Furthermore, it has been shown to function as a master regulator in diverse cancer entities such as breast cancer, acute myeloid leukemia (AML) and specific midline carcinomas. Within my thesis I investigated the gene expression profile after Brd4 knockdown obtained by mRNA Next Generation Sequencing. I was able to validate the regulation of Myc and its target genes through Brd4 and I identified a so far unknown role of Brd4 in the interferon (IFN) signaling pathways. Here, I specifically found that Brd4 regulates STAT1, a key protein in IFNα, β and γ processes. With endogenous Brd4 chromatin immunoprecipitations (ChIP Seqs) and luciferase reporter assays I further characterized STAT1 as a direct Brd4 target gene. The signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) is the exclusive mediator of interferon gamma (IFNy) signaling, an inflammatory mechanism for the protection against infections which is also required for the control of tumor growth. STAT1 showed a significant decrease after Brd4 knockdown and an increase after Brd4 elevation. I was also able to show an impact of Brd4 on STAT1 target gene expressions, specifically on the group of interferon stimulated genes (ISGs), such as the interferon inducible transmembrane proteins 1, 2 and 3 (IFITM1-3) and the lectin galactoside- binding soluble 3 binding protein (LGALS3BP). These genes are activated in response to IFNγ triggered phosphorylation of STAT1. Since inflammation is discussed not only as a major cause for but also a defense mechanism against cancers, I further investigated breast cancer cells with a known diminished IFNγ response. Here, I found a reduced level of Brd4 accompanied by a STAT1 reduction. A re-introduction of Brd4 resulted in a STAT1 upregulation. In addition, its target genes - such as interferon regulatory factors 1 (IRF1) and interferon alpha-inducible protein 6 (IFI6) - increased. These findings indicate a possible rescue mechanism and counteraction for interferon independent growth of tumor cells. Taken together, I was able to uncover a novel function of Brd4 in the regulation of the interferon gamma response. This has important implications in regard to the anti-proliferative and pro- apoptotic effects of IFNγ in tumors and suggests potential novel strategies for cancer therapies in the future.

Das zelluläre Bromodomänen Protein 4 (Brd4) ist ein transkriptioneller Regulator. Es bindet an Transkriptionsfaktoren, den positiven Transkriptionselongationskomplex und azetylierte Histon-Reste. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass es als übergeordneter Regulator in verschiedenen Tumorarten, wie zum Beispiel dem Brustkrebs und der akuten myeloischen Leukämie (AML), eine wichtige Rolle spielt. Als wesentlichen Bestandteil meiner Doktorarbeit habe ich das Genexpressionsprofil nach der Brd4-Reduktion untersucht, welches ich mit Hilfe von mRNA-Sequenzierung erstellt habe. Hierbei war es mir möglich, die transkriptionellen Abhängigkeiten von Myc und seinen Zielgenen zu bestätigen und einen bisher unbekannten Zusammenhang zu den Interferon (IFN) Signalwegen herzustellen. Hierbei fiel besonders die Regulation von STAT1 auf, welches das Schlüssel-Protein der IFNα, β and γ Prozesse darstellt. Anhand von endogenen Brd4-Chromatin-Immunpräzipitationen und Luziferase-Reporter-Experimenten konnte ich STAT1 weiterführend als direktes Zielgen von Brd4 identifizieren. Der Signalüberträger und Transkriptionsaktivator 1 (STAT1) ist der einzige Vermittler des Interferon gamma Signalweges, ein Bekämpfungsmechanismus gegen Virusinfektionen, der zusätzlich bei der Wachstumskontrolle von Tumoren eine wichtige Rolle spielt. STAT1 zeigte eine signifikante Herabregulierung nach der Brd4-Reduktion und einen Anstieg bei Brd4-Erhöhung. Des weiteren war es mir möglich zu zeigen, dass auch die STAT1-Zielgene, speziell die Subgruppe der Interferon stimulierten Gene (ISGs), wie zum Beispiel die Interferon induzierten Transmembranproteine 1, 2 und 3 (IFITM1-3), von der Brd4-Menge abhängig waren. Diese Gene werden durch die IFNγ angestoßene Phosphorylierung von STAT1 aktiviert und vermitteln die weiterführende Immun-Antwort. Entzündungsprozesse werden als bedeutende Auslöser von Krebs diskutiert, auf der anderen Seite jedoch auch als seine Bekämpfungsmechanismen. Mit diesem Hintergrund untersuchte ich Brustkrebszellen, welche sich durch ein bekanntes Fehlen der IFNγ-Antwort auszeichneten. In diesen identifizierte ich ein reduziertes Brd4-Level, das von einer ebenfalls reduzierten STAT1-Menge begleitet war. Eine Wiedereinführung von Brd4 resultierte in einem Anstieg von STAT1. Zusätzlich stieg auch die Expression seiner Zielgene an, unter anderem des Interferon regulierenden Faktors 1 (IRF1) und des Interferon alpha induzierbaren Proteins 6 (IFI6). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass es hierbei möglicherweise zu einer Umkehrung des zuvor bekannten Interferon unabhängigen Tumorwachstums kommt. Zusammenfassend konnte ich eine neue Funktion von Brd4 in der Regulation der Interferon gamma Antwort aufdecken. Diese hat eine besondere Bedeutung für die anti-proliferativen und pro- apoptotischen Effekte in Tumoren, die durch IFNγ vermittelt werden, welche potentiell neue Behandlungsstrategien für Krebs in der Zukunft nach sich ziehen könnte.