Molecular characterization of parasites of the Leishmania donovani complex causing visceral leishmaniasis in South and Central Asia

Abstract

Visceral leishmaniasis (VL) in Asia is caused by parasites of the Leishmania donovani complex- L. donovani sensu stricto in the Indian subcontinent, and Leishmania infantum in China and Central Asia. Transmission of VL due to L. donovani is thought to be anthroponotic whereas VL by L. infantum is clearly zoonotic. But many other aspects of epidemiology of VL in Asian foci, such as genetic diversity of parasites, distribution of the two species, and presence of genetically different population are not fully understood. The aim of this study was to characterize parasites from different Asian regions at species and strain levels by using molecular approaches. Species identification has been performed by amplification of the ribosomal internal transcribed spacer 1-PCR (ITS1-PCR) and subsequent RFLP or sequence analyses using DNA extracted from bone marrow aspirates and skin exudates spotted on filter paper or glass slide. Out of 39 specimens collected from VL and PKDL suspects in Bangladesh, 38 specimens were positive by ITS1-PCR whereas only 26 were positive by microscopic examination. The causative agent in all Bangladeshi VL cases was L. donovani. With the same approach L. infantum was confirmed as causative agent of VL in Uzbekistan and Tajikistan. This had been suspected earlier but could never been proven so far because of the failure to cultivate these parasites in vitro. ITS1-PCR was thus shown to be superior to the diagnosis of leishmaniasis compared to parasitological confirmation by microscopy due to its higher sensitivity and capacity for direct species identification. A multilocus microsatellite typing (MLMT) approach has been used to characterize strains of L. donovani and L. infantum from different Asian VL foci. This method has been shown to be highly discriminatory and reproducible, and the results can be stored in data bases and exchanged between different laboratories. Recently, MLMT proved to be useful for molecular epidemiological and population genetic studies in the L. donovani complex. In this study, MLMT was applied to investigate the genetic diversity of strains of L. donovani from the Indian subcontinent, and of strains belonging to the most widespread isoenzyme type of L. donovani, MON-37, as well as to define the relatedness of the L. infantum parasites isolated from Uzbeki and Tajiki VL cases to other members of the species complex. The majority of isolates from the Indian subcontinent were assigned to a very homogeneous population regardless of their geographical origin, clinical manifestation, and their in vitro or in vivo susceptibility to antimonial drugs. The circulation of a single homogeneous population of L. donovani is, most probably, related to the epidemic spread of VL in this area. When strains of zymodeme MON-37 from India, Sri Lanka, Kenya, Israel and Cyprus were compared by MLMT they were assigned to different distantly related genetically defined groups, according to their geographical origin. The zymodeme MON-37 was found to be paraphyletic and not pertaining to a single genetic entity. Finally, MLMT showed that L. infantum from Uzbekistan and Tajikistan belong to the predominating zymodeme MON-1 but form a separate genetic group distinct from MON-1 populations from Europe, the Middle East and North Africa. Parasites circulating in the Uzbeki and Tajiki foci most probably have been restricted there for a long time rather than having been recently introduced from elsewhere by human or animal reservoir migration. The present study demonstrates the usefulness of molecular methods that allow for differentiation of Leishmania parasites at species and strain levels for addressing key epidemiological questions that are of importance for improving VL control.

Die viszerale Leishmaniose (VL) in Asien wird durch Parasiten des Leishmania donovani-Komplex hervorgerufen, L. donovani sensu stricto auf dem indischen Subkontinent und Leishmania infantum in China und Zentralasien. Die Übertragung der VL verursacht durch L. donovani ist vermutlich anthroponotisch, während die VL verursacht durch L. infantum klar zoonotisch ist. Viele andere epidemiologischen Aspekte der VL in asiatischen Foci, so z.B. die genetische Diversität der Parasiten, die Verbreitung der beiden Spezies und das Vorkommen von genetisch unterschiedlichen Populationen sind noch nicht vollständig geklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Parasiten aus verschiedenen asiatischen Regionen auf Spezies- und Stamm-Ebene mit Hilfe molekularer Methoden zu charakterisieren. Die Spezies-Identifizierung wurde durch die Amplifizierung des ribosomalen “internal transcribed spacer“ 1 (ITS1-PCR) mit nachfolgender RFLP- oder Sequenzanalyse durchgeführt. Dazu wurde DNA verwendet, die von Knochenmarksaspiraten und Hautexudaten auf Filterpapier oder Glasobjektträgern extrahiert wurde. Von den 39 Proben, die von VL- und PKDL-Patienten in Bangladesh erhalten wurden, waren 38 Proben positiv in der ITS1-PCR während sich nur 26 als positiv in der mikroskopischen Untersuchung erwiesen. Das infektiöse Agens in allen VL-Fällen aus Bangladesh war L. donovani. Mit der gleichen Methode wurde L. infantum als der Verursacher der VL in Usbekistan und Tadshikistan bestätigt. Das war früher bereits vermutet worden, konnte jedoch noch nicht überprüft werden, weil bisher alle Versuche, den Erreger zu kultivieren, fehlschlugen. Die ITS1-PCR hat sich auf Grund der höheren Sensitivität sowie ihrer Kapazität zum direkten Nachweis der Leishmania-Spezies als überlegen gegenüber dem mikroskopischen Nachweis der Parasiten erwiesen. Die Methode der Multilocus-Mikrosatelliten- Typisierung (MLMT) wurde benutzt, um L. donovani- and L. infantum-Stämme aus verschiedenen asiatischen VL-Foci zu charakterisieren. Diese Methode ist hoch diskriminierend und reproduzierbar, und ihre Resultate können in Datenbanken niedergelegt und zwischen Laboratorien ausgetauscht werden. Vor kurzem haben mehrere Studien die Nützlichkeit der MLMT für molekular epidemiologische und populationsgenetische Untersuchengen des L. donovani-Komplex bewiesen. In dieser Arbeit wurde die MLMT angewandt, um die genetische Diversität von L. donovani-Stämmen vom indischen Subkontinent und von Stämmen, die zu dem am weitesten verbreiteten Zymodem von L. donovani, MON-37, gehören, zu untersuchen, sowie um das Verhältnis der L. infantum-Parasiten von usbekischen und tadshikischen VL-Fällen zu anderen Vertretern des Spezies-Komplex zu definieren. Die meisten der Isolate vom indischen Subkontinent wurden der gleichen sehr homogenen Population zugeordnet unabhängig von ihrer geographischen Herkunft, der klinischen Manifestation der Erkrankung und der in vitro oder in vivo Suszeptibilität gegenüber Antimonium-Präparaten. Die Zirkulation einer einzigen homogenen Population von L. donovani ist wahrscheinlich für die epidemische Ausbreitung der VL in diesem Gebiet verantwortlich. Der Vergleich von Stämmen des Zymodems MON-37 aus Indien, Sri Lanka, Kenia, Israel und Zypern mit Hilfe der ergab, dass sie zu verschiedenen nur entfernt verwandten genetischen Gruppen gehören, die mit ihrer geographischen Herkunft korrelieren. Das Zymodem MON-37 war paraphyletisch und stellte keine genetisch einheitliche Gruppe dar. Schließlich zeigte die MLMT, dass L. infantum aus Usbekistan und Tadshikistan zu dem dominierenden Zymodem MON-1 gehören, aber eine separate genetische Gruppe bilden, die sich von den MON-1-Populationen in Europa, dem Mittleren Osten und Nordafrika unterscheiden. Die Parasiten, die in den usbekischen und tadshikischen Foci zirkulieren, waren wahrscheinlich schon längere Zeit beschränkt auf diese Region und wurden nicht erst kürzlich durch die Migration von Menschen oder Tieren importiert. Diese Arbeit demonstriert den Nutzern molekularer Methoden, die die Differenzierung der Leishmania-Parasiten auf Spezies-und Stammebene gestatten, für die Klärung wichtiger epidemiologischer Fragen, die für die Verbesserung der VL-Kontrolle von Bedeutung sind.