Untersuchungen zur strukturellen Basis der Positionsspezifität der humanen 15-Lipoxygenase-2 sowie zur Expression des Enzyms beim Ovarialkarzinom

Abstract

Die konventionelle Klassifizierung tierischer Lipoxygenasen (LOXn), die eine heterogene Enzymfamilie bilden, erfolgt entsprechend ihrer Positionsspezifität der Arachidonsäure-oxygenierung. Aufgrund der steigenden Anzahl an Isoenzymen der einzelnen Spezies sowie der großen funktionellen Heterogenität erwies sich diese Einteilung zunehmend als unzureichend. Die strukturelle Grundlage für die Reaktionsspezifität von Lipoxygenasen wurde in der Vergangenheit intensiv untersucht. Dabei konnten verschiedene kritische Aminosäuren, die sogenannten Sequenzdeterminanten, für ausgewählte Lipoxygenaseisoformen identifiziert werden. Bisher gelang es jedoch nicht, ein für alle Isoformen anwendbares allgemeines Konzept für die strukturellen Ursachen der Reaktionsspezifität zu entwickeln. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Bedeutung der bisher bei anderen LOX-Isoformen identifizierten Sequenzdeterminanten für die Reaktionsspezifität der humanen 15-LOX-2 getestet. Dazu wurde das Enzym als rekombinantes N-terminales His-tag Fusionsprotein in E. coli exprimiert, die potentiellen Sequenzdeterminanten mittels ortsgerichteter Mutagenese verändert und anschließend die Spezifität der Arachidonsäure-oxygenierung mittels HPLC- Analysen quantifiziert. Auf der Grundlage der erhaltenen Ergebnisse kann die Anwendbarkeit des Triadenkonzepts, das für 12/15-LOXn verschiedener Spezies entwickelt wurde, auf die humane 15-LOX-2 ausgeschlossen werden (Publikation 3). Da die Reaktionsspezifität von LOXn wesentlich von der Enzym-Substrat- Wechselwirkung abhängt und diese Interaktion pH-abhängig sein sollte, wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals die Auswirkungen von Veränderungen des pH-Wertes auf die Positionsspezifität der humanen 15-LOX-2 untersucht. Dabei zeigte sich, dass sich die Reaktionsspezifität des Enzyms im pH-Bereich zwischen 6 und 8,5 kaum veränderte. Ortsgerichtete Mutagenese von ausgewählten Aminosäureresten induzierte jedoch eine deutliche pH-Abhängigkeit der Reaktionsspezifität. Die diesem Phänomen zugrunde liegenden molekularen Ursachen wurden diskutiert und die entscheidende Rolle eines Histidin-Restes aufgeklärt (Publikation 2). In verschiedenen Studien wurde die Beteiligung Eikosanoid-synthetisierender Enzyme bei der Karzinogenese in verschiedenen Organen nachgewiesen. Bisher gab es jedoch keine Untersuchungen der Bedeutung von LOX-Isoformen beim Ovarialkarzinom, das neben dem Mammakarzinom eine Hauptursache für die Letalität an gynäkologischen Malignomen ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Expression der 15-LOX-2 im maligne entarteten Gewebe (Primärtumor und Metastasen) mehr als 20-fach höher ist als im Normalgewebe (Publikation 1). Obwohl der molekulare Mechanismus der erhöhten 15-LOX-2 Expression bisher noch nicht aufgeklärt werden konnte, weisen diese Daten auf eine patho-physiologische Rolle des Enzyms bei der malignen Entartung von Ovarialzellen hin. Weiterhin stellt die 15-LOX-2 aufgrund des drastisch hochregulierten Expressionsniveaus einen potentiellen Tumormarker dar.

Lipoxygenases (LOXs) form a heterogenous family of lipid peroxidizing enzymes that catalyze oxygenation of polyunsaturated fatty acids to the corresponding hydroperoxides. According to the conventional nomenclature LOXs have been classified with respect to their positional specificity of fatty acid oxygenation. Due to the growing number of isoenzymes for the different species as well as their enormous functional heterogeneity this classification proved to be limited. The structural basis for the reaction specificity of LOXs was intensively examined in the past. Through it different critical amino acids, so call sequence determinants could be identified for selected isoenzymes. Until now it was not possible to develop a unifying concept for the structural basis of the reaction specificity for all isoenzymes. Initially the meaning of prior identified sequence determinants of other LOX isoformes was tested for the human 15-lipoxygenase-2. For that the enzyme was expressed as a recombinant His-tagged fusion protein in e.coli and the potential sequence determinants were changed through site-directed mutagenesis. Afterwards the specificity of the oxygenation reaction was quantified via HPLC analysis. On the basis of the received results you can exclude the applicabilitiy of the triad concept for the human 15-LOX-2 (publication 3). As the reaction specificity of LOXs is considerably depending from the enzyme substrate interaction and the latter should be pH sensitive, I examined for the first time the effect of pH changes for the position specificity of the human 15-LOX-2. The wild type showed nearly no change of the reaction specificity in the pH range from 6 to 8.5. Compared with this site-directed mutagenesis from selected amino acids induced a significant pH dependence of the reaction specificity. The underlying molecular reasons for this phenomenon were discussed and the crucial role of a selected Histidin was clarified (publication 2). Several studies established the proof of the participation of eicosanoid producing enzymes in carcinogenesis of different organs. Until now there were nearly no examination of the meaning of LOX isoforms in the development of ovarian cancer, which is next to breast cancer one of the leading causes for the lethality through gynaecological cancer. During my studies I could show, that the expression of the 15-LOX-2 tumor tissue ( primary tumor and metastases) is elevated more than 20-fold (publication 1). Although there is still a lack of knowledge about the molecular mechanism of elevated expression of 15-LOX-2 until now, the data suggest a patho- physiological role of the enzyme in the carcinogenesis of ovarian cells.