Characterization of a Low Temperature Inducible Protein (BN26)

Abstract

Cold acclimatization of plants is a multigenic trait during which multiple genes are expressed. One of the Arabidopsis thaliana cryoprotectant protein COR15A homologues in Brassica napus or Brassica oleracea with unknown function is BN26. The gene for BN26 was cloned from Brassica oleracea and expressed in Pichia pastoris as a native protein without signal sequence and purified by reverse phase chromatography on Amberlite XAD7. A significant advantage offered by the use of the Amberlite XAD7 matrix is that the dried protein fractions can be stored without loss of activity for up to 4 to 6 months in the refrigerator and for one year in the freezer. One main result obtained in this PhD thesis was the lack of secondary structural elements of BN26 in solution together with stress-induced folding of new secondary structure elements. Structural analysis via circular dichroism spectroscopy experiments revealed the folding of natively unstructured BN26 proteins during drying to mainly α-helical structure. Another diagnostic feature for unstructured proteins is their high proteolytic sensitivity. The higher protease sensitivity of unstructured proteins results from their open structure. Therefore, the polypeptide chain of unstructured proteins is more accessible to proteases than that of globular proteins. For BN26 sensitivity to proteolytic degradation could be shown, pointing to the flexible nature. In contrast, the globular protein lysozyme remains intact under the same conditions. Further characterization in my thesis was done to enlighten the mode of action of BN26 protein. Thereby, both membrane and protein stabilization properties under stress were suggested as a possible mechanism of protection. BN26 protected thylakoids against freeze-thaw damage by binding to thylakoid membranes as shown by western blot analysis. Interestingly, BN26 shows in comparison to its high cryoprotecting ability for whole thylakoids just poor cryprotection ability for liposomes mimicking thylakoid membrane. Furthermore, BN26 has been shown to exhibit in vitro cryoprotective activity on the freezing-labile enzyme, L-lactate dehydrogenase (LDH), against freeze- induced inactivation in vitro. The protection of proteins during drying on an LDH-assay could also be shown for BN26 protein. In addition we examined the refolding activity of BN26 using firefly luciferase as a substrate. BN26 was found to stimulate folding of the molecule indicating a chaperone activity of BN26. In conclusion our data indicate that BN26 functions as protectant against various stresses. Furthermore I could show in pull-down assays that only stress treated BN26 but not unstressed BN26 can bind to LDH. This is interesting regarding the fact that secondary structure elements in BN26 are formed via stress treatment. I suggest that the structural changes of BN26 are necessary for binding to potential targets and even more for its function as protectant against various stresses.

Bei der Kälteakklimatisation von Pflanzen spielen eine Vielzahl von Genen eine Rolle. Diese Arbeit untersucht das bis dahin funktionell nicht beschriebene Protein BN26. Das Brassica napus und Brassica oleracea Protein BN26 ist homolog zu dem Arabidopsis Frostschutz Protein COR15A. Die kodierende Sequenz von BN26 wurde aus Brassica oleracea isoliert. Die Expression erfolgte als natives Protein ohne Signalsequenz in Pichia pastoris. Die anschließende Aufreinigung erfolgte mittels Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer Amberlite XAD7 Matrix. Ein wesentlicher Vorteil bei der Verwendung der Amberlite XAD7 Matrix ist, dass die getrockneten Proteinfraktionen ohne Aktivitätsverlust 4 bis 6 Monate im Kühlschrank und ein Jahr im Gefrierschrank gelagert werden können. Ein Hauptresultat dieser Arbeit ist das Fehlen von Sekundärstrukturelementen im gelösten BN26 und die stressabhängige Ausbildung neuer Sekundärstrukturen. In der Charakterisierung der BN26 Sekundärstruktur mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte ein hoher Anteil an ungefalteten Proteinregionen im gelösten BN26 und eine dem Wasserentzug folgende deutliche Zunahme an α-Helices beobachtet werden. Ein anderes Verfahren zum Nachweis von Proteinen mit einer großen Anzahl an unstrukturierten Bereichen in der Sekundärstruktur macht sich die Empfindlichkeit solcher unstrukturierten Proteinbereiche gegenüber Proteasen zunutze. Die höhere Protease-Empfindlichkeit von unstrukturierten Proteinen ergibt sich aus ihrer offenen Struktur. Die Protease kann an die Polypeptidkette von unstrukturierten Proteinen deutlich besser binden als an die von globulären Proteinen. Es gelang für gelöstes BN26 eine hohe Proteasesensitivität nachzuweisen, was auf einen hohen Anteil an unstrukturierten Proteinregionen hindeutet. Im Gegensatz dazu war unter den gleichen experimentellen Bedingungen für das globuläre Proteins Lysozym ein deutlich höherer Anteil des gesamten Proteins intakt und unverdaut. Eine weitere Charakterisierung von BN26 im Rahmen meiner Doktorarbeit diente der funktionellen Untersuchung. Als mögliche Mechanismen des abiotischen Stressschutzes wurden die Stabilisation von Membranen und Proteinen diskutiert. Für BN26 konnte eine Funktion beim Schutz von Thylakoiden gegen Frost-Tau-Schäden und eine Bindung an Thylakoidmembranen durch Western-Blot- Analyse gezeigt werden. Interessanterweise konnte im Gegensatz zum Frostschutz von Gesamt-Thylakoiden nur ein geringer Frostschutz von Liposomen, die als Modell für Thylakoidmembranen verwendet wurden, durch BN26 beobachtet werden. Des Weiteren schützte BN26 das kälteempfindliche Enzym L-Lactatdehydrogenase (LDH) beim Einfrieren in vitro vor einem Aktivitätsverlust. Auch bei Wasserentzug durch Trocknen konnte eine schützende Funktion von BN26 für LDH gezeigt werden. Zudem konnte für das Substrat Luciferase gezeigt werden, dass BN26 die Faltung von Proteinen stimuliert, was auf eine Funktion als Chaperon hinweist. Die Daten zeigen eine Funktion von BN26 als abiotisches Stress- Schutzprotein auf. Außerdem konnte ich in Pull-Down Untersuchungen zeigen, dass nur Stress-behandeltes BN26 Protein, aber nicht "ungestresstes" BN26 LDH binden kann. Das ist interessant im Hinblick auf die Tatsache, dass durch Stress-Behandlung sekundäre Strukturelemente in BN26 gebildet werden. Ich schlage vor, dass die strukturellen Veränderungen in BN26 notwendig für die Bindung an potenzielle Ziele und noch mehr für seine Funktion als Schutzmittel gegen verschiedene Stressfaktoren sind.