Untersuchung des Einflusses des Nicht-Strukturproteins 5A des Hepatitis C Virus auf Zellwachstum, Apoptose und Karzinogenese in vitro und in vivo

Abstract

Das Hepatitis C Virus ist ein membranumhülltes Virus mit einem +SS-RNA Genom aus der Familie der Flaviviridae. Sein Genom codiert für die Strukturproteine Core, E1 und E2, das p7-Protein und für die Nicht-Strukturproteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B. Da das Nicht-Strukturpotein 5A unter anderem in der Lage ist, mit zentralen Signalwegen für Zellwachstum und Differenzierung zu interferieren, wird dem Protein eine Rolle bei der HCV-assoziierten Entstehung von Leberpathologien bis hin zur HCC-Bildung zugeschrieben. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der HCV-Replicon-Zelllinien huh9-13 und huh ET auf die rezeptorvermittelte Apoptose untersucht. Dabei konnte mit Hilfe von Western Blot-Analysen und durchflusszytometrischen Quantifizierungen apoptotischer Zellen, eine gesteigerte Sensitivität von huh9-13 aber nicht von huh ET -Zellen im Bezug auf TNFα\- und TRAIL-vermittelte Apoptose, verglichen mit der Ausganszelllinie huh7, beobachtet werden. Diese Unterschiede spiegelten sich auch im Expressionsmuster von apoptoserelevanten Genen wieder, wie durch Membranen-Arrays beobachtet werden konnte. Nach Entfernung der HCV- Replicon-RNA aus den Zellen mittels IFNα-Behandlung zeigten so behandelte huh9-13 Zellen keine gesteigerten Sensitivitäten mehr, was für einen Einfluss des entsprechenden Replicons auf die rezeptorvermittelter Apoptose offenbart. Im Falle der huh ET Zellen hatte die IFN-Behandlung keinen Effekt. Zudem konnte durch die Verwendung von Etoposide und Actinomycin D gezeigt werden, dass der intrinsische Apoptoseweg durch die HCV-Replicons nicht beeinflusst wurde, jedoch wurde ein starker Einfluss des jeweiligen Zellhintergrundes beobachtet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt von NS5A auf den Raf-1/ERK-abhängigen MAP-Kinasesignalweg näher untersucht. Bei der Verwendung von phosphospezifischen Antikörpern konnte nach NS5A-Expression eine gesteigerte Phophorylierung von Raf-1 an dem Serinrest 338 beobachtet werden. Jedoch wurde keine Steigerung der MEK1/2-Phosphorylierung an den Serinresten 217/221 festgestellt. Durch die Verwendung von NS5A-Deletionsmutanten konnte die Region AS 302-449 als ausreichend für die gesteigerte Raf-1 Phosphorylierung identifiziert werden. Dabei korrelierte die Lokalisation der Deletionsmutanten mit der Art des Effektes auf die Raf-1-Phosphorylierung. Durch die Verwendung verschiedener Inhibitoren konnte zudem gezeigt werden, dass die Raf-1-Phosphorylierung unabhängig von der PKC-Aktivität war. Ein dritter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Charakterisierung einer neuen NS5A-transgenen Maus zur Untersuchung einer möglichen Rolle von NS5A bei der HCV-assoziierten Leberschädigung. Mit Hilfe von Western Blot-Analysen konnte eine robuste, leberspezifische und über die Zeit stabile NS5A-Expression in männlichen sowie in weiblichen Tieren festgestellt werden. Zudem war die Expressionsstärke bei zwei verschiedenen founder-Linien vergleichbar. Es konnte keine Tumorentstehung oder Zellschädigung in den Lebern transgener Tiere festgestellt werden, auch nicht nach der Bestrahlung der Tiere mit einer subletalen Dosis von 3 Gy. Um Transgen-bedingte Änderungen der Genexpression zu untersuchen, wurden Microarray- und Proteomanalysen von transgenen und Kontrolltieren durchgeführt. Dabei konnte sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene gezeigt werden, dass die Expression unterschiedlicher Gene durch NS5A beeinflusst wurde. Um den postulierten inhibitorischen Effekt von NS5A auf die IFN-Antwort zu untersuchen, wurden transgene und WT-Mäuse mit LCMV infiziert. Dabei konnte im Falle der transgenen Tieren eine inhibierte Viruseliminierung und eine gesteigerte GPT-Aktivität in den Seren nachgewiesen werden. Zudem wurde in transgenen Lebern eine verminderte Induktion von 2´,5´-OAS und PKR festgestellt. Diese Daten sprechen für einen inhibitorischen Einfluss von NS5A auf die IFN-abhängige antivirale Antwort der Zellen, was zu einer Chronifizierung der HCV-Infektion beitragen könnte.

The hepatitis C virus (HCV) is an enveloped positive-strand RNA virus which belongs to the family of the Flaviviridea. The genome codes for the structural proteins core, E1 and E2 and the nonstructural proteins p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B. Because the nonstructural protein 5A is able to deregulate important signalling cascades for cell proliferation and differantiation, the protein is thought to play a major role in the development of HCV-associated HCC progression. In the first part of this work the influence of two subgenomic HCV replicons, huh9-13 and huh ET cells, on death receptor-mediated and intrinsic apoptosis was investigated. Based on Western blot experiments and FACS analysis an increased sensitivity of huh9-13 but not of huh ET replicon cells towards TNFα\- and TRAIL-mediated apoptosis compared to huh7 control cells was observed. This difference in the sensitivity to death receptor-mediated apoptosis is reflected in a variety of differentially regulated genes involved in apoptosis induction as determined by a membrane array. After elimination of the replicon RNA by IFNα treatment, the increased sensitivity of huh9-13 cells was abolished elucidating an influence of the HCV replicon on receptor mediated apoptosis for huh9-13 cells. In the case of huh ET cells the interferon treatment did not restore the sensitivity to TNFα-dependent apoptosis. Using etoposide and actinomycin D for the induction of apoptosis, no effect of the replicon RNA on the intrinsic apoptotic pathway could be detected, however strong effects of the cellular background have been detected. In the second part of this work the effect of NS5A on MAPK signalling was examined. Using phophospecific antibodies an increased Raf-1 phosphorylation at serin 338 was observed, which was caused by NS5A expression. Unexpectedly, the increased Raf-1 phosphorylation had no effect on MEK1/2 phosphorylation at serin 217/221. Investigating different NS5A deletion mutants, a region between amino acid 302-449 was identified to be sufficient for increased Raf-1 phosphorylation. Thereby a correlation of NS5A mutant localisation and measured effect on Raf-1 phosphorylation has been observed. Inhibition of different kinases involved in MAPK signalling revealed no participation of PKC. In the third part of this work a new NS5A transgenic mouse was characterized to elucidate the potential role of NS5A for HCV- associated liver damage. The mice were genotyped using PCR. Robust, liver specific and long term transgene expression was monitored by Western blot analysis showing an equivalent NS5A expression in two different founder strains. In transgenic mice no tumour formation or liver damage was detected not even after irradiation of mice with sub-lethal doses of 3 Gy gamma radiations. To investigate alterations in gene expression triggered by NS5A, transgenic mice and wild type littermates were subjected to microarray and proteome analysis detecting several genes altered on mRNA or protein level. To control the postulated effect of NS5A on the interferon response the mice were infected with LCMV. In the transgenic mice a reduced virus elimination and elevated GPT-activity in the sera was observed. On the molecular level an impaired induction of 2´,5`-OAS and of PKR was observed in transgenic liver samples. These results argue for an inhibitory effect of NS5A on interferon- mediated antiviral response which could mediate a chronic progression in case of HCV infection.