Identification of novel mechanisms controlling cell cycle progression in S. cerevisae

Abstract

Understanding the complex interplay between cell cycle regulators in functional contexts poses a great challenge, since an involvement of these proteins in multiple pathways, driving expression of genes according to environmental conditions, effected growth of mitotic and maintenance of postmitotic cells. The dysregulation of cell cycle components can result in a decline of cellular function eventually leading to senescence, apoptosis, cancer, aging and age-related diseases such as neurodegenerative disorders. To gain insight into the function of proteins driving cell cycle progression, and to identify regulatory networks potentially relevant for these diseases, interaction studies have been performed. Specifically, associations between the regulatory subunits of heterodimeric cyclin-dependent kinases complexes called B-type cyclins (Clbs) and Sic1, a specific stoichiometric inhibitor of the Cdc28-Clb complexes were investigated. The experimental analyses combined with recent computational studies highlighted an additional role for Sic1 in the regulation of Cdc28-Clb complexes, acting as a timer in their regulation [236]. In addition, the role of Forkhead (Fkh) transcription factors Fkh1, Fkh2 and the coactivator Ndd1 in the coordination of Cdc28-Clb activities required for S/G2 and G2/M transitions of the cell cycle was analyzed. Therefore, the specificity of B-type cyclins to interact with Fkh1 and Ndd1 as well as a potential association between Fkh1 and Ndd1 was tested. Importantly, all B-type cyclins Clb1-6 was found to bind Ndd1 and both Fkh transcription factors including Clb2 and Clb5 which have been previously implicated to target Fkh2 for Cdc28-dependent phosphorylation. Moreover, the results validated an involvement of Fkh1 in the periodic activation of B-type cyclin genes due to the association with Ndd1. In addition, a potential role of Clb3 in priming Ndd1-dependent CLB2 cluster transcription was identified. Considering that Fkh transcription factors bind at CLB1-4 promoters, this result further demonstrates that the Fkh transcription factors could also play a role in promoting the expression of early mitotic cyclins to timely regulate cell cycle progression. Furthermore, the data presented in this study indicated that Fkh1 and Fkh2 might act as a platform to recruit both the coactivator Ndd1 in S phase and the histone deacetylase Sir2 in late M phase in a mutual exclusive manner. Sir2, a histone deacetylase known to promote stress response and longevity pathways might be involved in repression of CLB2 to control mitotic growth of yeast cells. Consistently, the Fkh-Sir2 interplay was further demonstrated to be relavant for stress resistance including exposure to oxidants, calorie restriction and protein aggregation caused by the polyglutamine protein Huntingtin. The results in the course of this thesis further demonstrate that Sir2-dependent chromatin silencing in response to stress represses Fkh-controled cell cycle genes such as CLB2. Importantly, a direct link between Sir2-dependent chromatin silencing in response to stress and Fkh-mediated regulation of cell cycle components such as CLB2 has not been considered before.

Die Vertiefung des Verständnisses komplexer Zusammenhänge von Zellzyklusregulatoren stellt eine große Herausforderung dar, da Komponenten dieses Regulationsapparats an der Koordination zahlreicher zellulärer Vorgänge beteiligt sind, die in Abhängigkeit von Umwelteinflüssen die Zellteilung steuern und so das Wachstum und die Entwicklung vielzelliger Organismen maßgeblich beeinflussen. Das Versagen dieser Kontrollmechanismen kann schließlich zu Krebs, Seneszenz, Apoptose und alters-abhängigen Erkrankungen, z.B. neurodegenerative Erkrankungen, führen. Ziel dieser Arbeit war es, Einsichten in die Proteinfunktion von Zellzyklusregulatoren zu erlangen, um regulatorische Netzwerke zu identifizieren, die für die Entstehung dieser Erkrankungen relevant sein könnten. Hierzu wurden Protein-kodierende Sequenzen bekannter Zellzyklusregulatoren kloniert und Protein-Interaktionsstudien in vivo und in vitro vorgenommen. Dazu erfolgte zunächst eine Untersuchung der Assoziation von regulatorischen Untereinheiten heterodimerischer Kinasekomplexe, den B-Typ Cyclinen (Clbs) und Sic1, einem spezifischen stoichiometrischen Inhibitor dieser Cdc28-Clb Komplexe. Die experimentellen Interaktionsdaten sowie bestehende mathematische Modellierungen führten so zu neuen Erkenntnissen über die Funktion von Sic1 in der Zellzyklus-abhängigen Steuerung von Cdc28-Clb1-6 [236]. Des weiteren wurde ein Einfluss der Forkhead (Fkh) Transkriptionsfaktoren Fkh1, Fkh2 und des Koaktivators Ndd1 auf die Koordination der Cdc28-Clb Aktivität, welche für den Übergang der Zellzyklusphasen S/G2 und G2/M verantwortlich sind, untersucht. Hierzu wurde die Interaktion der B-Typ Cycline mit Fkh1, Fkh2 und Ndd1 getestet, sowie eine potentielle Bindung zwischen Fkh1 und Ndd1 analysiert. Diese Untersuchung ergab, dass Clb1-6 mit Ndd1 und beiden Transkriptionsfaktoren Fkh1 und Fkh2 interagiert, welche die bereits bekannte Bindung von Fkh2 mit Clb2 und Clb5 einschließt. Zudem konnte in dieser Arbeit die Bindung des bisher als Fkh2-spezifisch beschriebenen Koaktivators Ndd1 mit Fkh1 gezeigt werden. Eine sich daraus ableitende Beteiligung beider Forkhead Transkriptionsfaktoren an der transkriptionellen Aktivierung von frühen mitotischen Cyclinen wie Clb3 und Clb4 konnte mittels genetischer und biochemischer Untersuchungen bestätigt werden. Darüber hinaus konnte eine potentielle Rolle von Cdc28-Clb3 bei der Initiation der Expression von G2/M-Genen, einschließlich CLB2, identifiziert werden. Schließlich wurde eine funktionelle Rolle der Histondeacetylase Sir2 bei der Forkhead-vermittelten transkriptionellen Repression von CLB2 ermittelt. Frühere Studien zeigten, dass die Regulation der Fkh-abhängigen Transkription mitotischer Zellzyklusgene von der Aktivität spezifischer B-Typ Cyclin-Kinase Komplexe abhängt. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse weisen daraufhin, dass Fkh1 und Fkh2 als Chromatin-bindende Gerüstproteine dienen, welche Koregulatoren wie Ndd1 in der S-Phase und Sir2 in der späten M-Phase des Zellzyklus rekrutieren. Eine Interaktion zwischen Fkh Proteinen und Sir2 erscheint auch für Stressresistenz von Hefezellen von Bedeutung, welche oxidativen Stress, Kaloriebegrenzung und Proteinaggregation von zytotoxisch wirksamen Huntingtin mit verlängertem Glutaminstretch einschließt. Ein Zusammenhang zwischen der Sir2 abhängigen Stressantwort und wichtigen Zellzyklusregulation wie Fkh1 und Fkh2, welche die Repression der Expression von Genen mitotischer Cycline durch epigenetische Mechanismen einschließt, wurde bisher nicht in Betracht gezogen.