Transkriptionelle Regulationsmechanismen und Interaktionsstudien des plasticity related gene 1

Abstract

Die Informationsübertragung im ZNS verläuft über synaptische Verbindungen und kann durch diese moduliert werden. Plasticity related gene 1 (PRG-1) wurde kürzlich als Modulator der exzitatorischen Informationsübertragung an Synapsen beschrieben. Gemäß des derzeit postulierten Mechanismus verändert das postsynaptisch lokalisierte PRG-1 den Gehalt an bioaktiven Lipiden im synaptischen Spalt und moduliert auf diese Weise die Signalweiterleitung über die präsynaptisch lokalisierten LPA2-Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Mausmodell erzeugt, welches das Reportergen „yellow fluoresent protein“ (YFP) unter Kontrolle von Elementen des nativen PRG-1 Promoters exprimiert. Die Expression des Reporters im erzeugten Mausmodell wird durch 200 kb kotransferierte genomische Sequenz, die den Transkriptionsstart von PRG-1 umschließt, gesteuert. Nachfolgende immunhistologische Untersuchungen dokumentierten, daß die gewählten 200 kb Sequenz ausreichen, um sowohl die gehirnspezifische Expression von YFP, als auch die PRG-1 spezifische Expression des Reporterproteins in diversen Neuronentypen zu steuern. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der transkriptionellen Regulation von prg1. Mittels RLM-Race wurde erstmals dokumentiert, daß die Transkription von PRG-1 über multiple Transkriptionsstartorte initiiert wird. Ein weiter stromaufwärts gelegener Transkriptionsstart, der vorab publiziert wurde, konnte mittels PCR-Analyse bestätigt werden. Mittels Reportergenassays von Deletionskonstrukten in primären kultivierten Neuronen bzw. Astrozyten, konnte die Sequenz eines Minimalpromoters identifiziert werden, der eine ca. vierzigfache transkriptionelle Stimulation in Neuronen erzeugt. Die Funktionalität des identifizierten Minimalpromoters konnte durch Elektroporation eines Reportergenkonstrukts in organotypische Slicekulturen dokumentiert werden. Mittels EMSA wurde der identifizierte Minimalpromoter untersucht und Sequenzabschnitte identifiziert, an denen DNS-Proteinkomplexe nachgewiesen werden konnten. In silico Analysen ermittelten konservierte Bindemotive für die Transkriptionsfaktoren SP1 und CREB. Im Anschluß konnte die nachgewiesenen DNS/Proteinkomplexe spezifisch durch Konsensusoligonukleotide der Sequenz von SP1 und CREB kompetetiert werden. Eine Nex1 mediierte transkriptionelle Regulation von PRG-1 war zu Beginn dieser Studie bekannt. Mittels Kotransfektionen eines Nex1-Expressionsvektors wurde nachgewiesen, daß kein signifikanter Einfluß von Nex1 auf den identifizierten Minimalpromoter vorliegt, so daß ein neuartiger Regulationsmechanismus von PRG-1 beschrieben wurde. Mittels Western Blot Analysen konnte keine Veränderung des PRG-1 Gehalts in Gesamthirnhomogenaten von Nex1 defizienten Mäusen festgestellt werden. Lokalisationsveränderungen von PRG-1 konnten durch Untersuchungen der im Rahmen dieser Arbeit erzeugten Reportermaus ausgeschlossen werden. Eine weitere Zielstellung dieser Arbeit war die Identifikation möglicher Interaktionspartner von PRG-1. Durch den „Yeast Two-Hybrid Sreening Service at DKFZ“ wurde ein Two-Hybrid-Screen durchgeführt, der NSF als möglichen Interaktionspartner prognostizierte. Diese Interaktion konnte durch Immunpräzipitationen von in HEK 293-Zellen überexprimierten affinitätsmarkierten Proteinen bestätigt werden. Nachfolgend konnte NSF auch aus Gesamthirnhomogenaten durch an Protein A-Sepharose gekoppelte PRG-1 Antikörper präzipitiert werden, die im Rahmen dieser Arbeit hergestellt wurden.

Transmission of information in the CNS is processed via synaptic connections and is modulated. The protein plasticity related gene 1 (PRG-1) was recently described as modulator of excitatory synaptic transmission. According to the current postulated mechanism, the postsynaptic expressed PRG-1 modifies the concentration of bioactive lipids in the synaptic cleft and modulates thereby the signal transmission via the presynaptic localized LPA2-receptors. In the present study a mouse model was generated expressing the reporter gene yellow flourescent protein (YFP) under control of elements from the native PRG-1 promoter. Expression of the reporter was controlled by a 200 kb cotransfected sequence, encompassing the transcription start site of prg1. Immunohistologic analysis of the generated reporter mouse documented that the choosen 200 kb sequence stretch was effectual to confer strict neuronal expression of YFP. Additional all regulation elements necessary for the intraneuronal expression pattern of PRG-1 seem to be present on the tranferred sequence stretch. Another aim was the analysis of prg1 transcriptional regulation. Using RLM- race it could be shown that transcription of prg-1 is initated at multiple start points. Another transcription start point localized further upstream which was previously published from our group could be confirmed with PCR- analysis. Reporter gene-assays of deletion constructs in primary cultivated neurons and astrocytes identified the sequence of a minimal promotor, which stimulates specific transcription in neurons forty-fold. The functionality of the identified minimal promotor could be documented via electroporation of a reporter gene construct in organotypic slice constructs. Investigation of the identified minimal promoter via EMSA determined sequence fragments with DNA- protein-complexes. In silico analysis revealed conserved binding sites for the transcription factors SP1 and CREB in the rodent and human minimal promoter sequence. The detected DNA-protein-complexes could be specifically competed with SP1 and CREB consensus oligonucleotides. The direct regulation of PRG-1 transcription through the transcription factor Nex1 was published prior to this study. The question emerged, if transcriptional regulation of the identified minimal promoter was influenced by Nex1. No significant transcriptional stimulation could be detected in cotransfection experiments with a Nex1 expression vector, indicating a new Nex1 independent regulation mechanism. No alteration regarding the PRG-1 protein content in brain homogenates was detected in Nex1 deficient mice via western blot analysis. No variation regarding the spatial expression of PRG-1 could be detected via analysis of reporter gene expression in the generated PRG-1 reporter mouse. Another aim of this study was the identification of putative interaction partners of PRG-1. The cytoplasmatic C-terminus of PRG-1 was subcloned in an expression vector, which was used in a two-hybrid assay performed by “Yeast Two-Hybrid Sreening Service at DKFZ”. NSF was identified as putative interaction partner. This interaction was confirmed by immunoprecipitation of affinity tagged proteins expressed in HEK 293 cells. Furthermore this interaction was corroborated by co-precipitation of NSF via protein A-sepharose coupled PRG-1 antibodies, which were generated as part of this study.