Endotheliale Progenitorzellen und Natürliche Killerzellen bei Allogener Stammzelltransplantation und Tumor-Immuntherapie

Abstract

Immuntherapien für Krebserkrankungen haben in den letzten Jahrzehnten mehr und mehr Eingang in die klinische Praxis gefunden. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-KMT) ist zurzeit die effektivste Immuntherapie für maligne Erkrankungen. Der therapeutische Nutzen der allo-KMT bei malignen Erkrankungen ist zum Großteil durch die so genannte graft-versus-tumor (GVT) Aktivität von Immunzellen des Spenders vermittelt. Leider ist die allo-KMT kein komplikationsarmes Verfahren: Die graft-versus-host Krankheit (GVHD) ist eine progressive systemische Entzündung, die vor allem den Darm, die Leber und die Haut betrifft und erhebliche Morbidität und Mortalität verursacht. Ein großes klinisches Problem stellt die Prophylaxe und Therapie der GVHD dar. Heutzutage angewandte therapeutische Strategien beeinträchtigen die T Zell Funktion und führen zu erhöhtem Risiko eines Tumor Rückfalls. Daher sind wir an der Entwicklung therapeutischer Strategien interessiert, die sich durch eine hohe Effektivität gegen die GVHD auszeichnen ohne die GVT Aktivität negativ zu beeinflussen. Eine von uns neu beschriebene therapeutische Strategie bei GVHD ist die Hemmung der Neovaskularisierung durch spezifische Depletion von Endothelialen Progenitorzellen (EPCs). Zur Neovaskularisierung beim erwachsenen Menschen tragen sowohl die Angiogenese, das Sprießen von gewebeständigen Endothelzellen (ECs), als auch die Vaskulogenese, die Rekrutierung von im Knochenmark entstandenen zirkulierenden EPCs, bei. Es besteht eine Verbindung zwischen der Neovaskularisierung, dem Wachstum von Blutgefäßen, zu verschiedenen entzündlichen Erkrankungen sowie zu Tumorerkrankungen. Daher haben wir die Bedeutung von Angiogenese und Vaskulogenese für Entzündungen in Mausmodellen für die GVHD untersucht. Wir konnten herausfinden, dass die GVHD durch vermehrte Neovaskularisierung in GVHD Zielorganen charakterisiert ist. Dabei demonstrierten wir eine besonders wichtige Bedeutung der Vaskulogenese für die Entzündung während der GVHD. Wir haben einen monoklonalen Antikörper (E4G10) gegen das vaskuläre endotheliale Adhesionmolekül VE-cadherin eingesetzt, um EPCs zu depletieren und damit spezifisch die Vaskulogenese zu hemmen. Als Folge der EPC Depletion haben wir eine Hemmung der Neovaskularisierung beobachtet, die zur Verbesserung der systemischen und organspezifischen GVHD mit Überlebensvorteil führte. In Experimenten, bei denen allo-KMT Empfänger sowohl Tumorzellen als auch allogene T Zellen intravenös verabreicht bekommen haben, konnten wir einen simultanen positiven Effekt der EPC Depletion auf Tumorwachstum und GVHD beobachten, der zu einem erheblichen Überlebensvorteil der E4G10 behandelten allo-KMT Empfänger führte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung der Vaskulogenese mittels der Depletion von EPCs eine einzigartige Möglichkeit darstellt, um die beiden wesentlichen Komplikationen der allo-KMT (GVHD und Tumor Rückfall) mit einer therapeutischen Strategie zu behandeln. Ein weiterer Ansatz zur Entwicklung von neuen therapeutische Strategien bei der GVHD ist die Nutzung der hohen Anti-Tumor Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK Zellen). Klinische Daten zeigen, dass die Allo-Reaktivität von Spender NK Zellen gegen Empfänger Tumorzellen entscheidend zur Anti-Tumor Aktivität einer allo-KMT beiträgt. Um verschiedene Einflussfaktoren auf die NK Zell Aktivität nach allo-KMT untersuchen zu können haben wir eine Methode etabliert, mit der verlässlich und genau die NK Reaktivität gegen Tumorzellen auf einer Einzelzellebene erfasst werden kann. Unsere Methode beruht auf der durchflusszytometrischen Erfassung von CD107a, einem Granula-membranprotein, was bei der Degranulation von NK Zellen an der Zelloberfläche expremiert wird. Mit dieser Methode konnten wir Einflussfaktoren auf die NK Zell Aktivität nach allo-KMT nachweisen: 1) Das Konditionierungsregime - wir fanden eine erhöhte NK Zell Aktivität gegen Tumorzellen nach allo-KMT mit reduzierter Konditionierung. Die hohe Anti-Tumor Reaktivität von NK Zellen ist eine mögliche Erklärung der guten klinischen Effektivität der allo-KMT mit reduzierter Konditionierung. 2) Die T Zell Depletion – wir fanden eine erhöhte NK Zell Toxizität für Alemtuzumab (Campath) in vivo im Vergleich zu Thymoglobulin (Kaninchen ATG). Unsere Ergebnisse liefern die pathophysiologische Grundlage für klinische Berichte über ein erhöhtes Risiko von Tumorrückfällen nach allo-KMT bei T Zell Depletion mit Alemtuzumab und legen einen kritischen Umgang mit Alemtuzumab bei der allo-KMT nahe.

Neovascularization has been implicated in tumor growth and inflammation. Blood vessels are either formed by sprouting of resident tissue endothelial cells (ECs, angiogenesis), or by recruitment of bone marrow-derived circulating endothelial progenitor cells (EPCs, vasculogenesis). The role of neovascularization and its mechanisms in graft-versus-host disease (GVHD) and in tumors after allogeneic bone marrow transplantation (allo-BMT) are not known. In murine allo-BMT models we analyzed the vascular density, ECs and EPCs by immunofluorescence microscopy and by flow cytometry. We used an antibody (E4G10) against monomers of the vascular endothelial adhesion molecule VE-cadherin to inhibit neovascularization without affecting host vasculature. We analyzed GVHD by survival, clinical scoring, histopathology, immunohistochemistry, flow cytometry, cytokine immunoassay and gene array. We assessed tumors by survival, clinical scoring, histopathology and bioluminescence imaging. We found increased neovascularization in GVHD target tissues, such as liver and intestines. Interestingly, neovascularization during GVHD was mediated by vasculogenesis, as opposed to angiogenesis. We adoptively transferred selected GFP+ EPCs and observed recruitment to the neovasculature in the liver and intestines during GVHD, as well as to tumor neovasculature after allo-BMT. Next, we administered E4G10 to allo-BMT recipients and found depletion of EPCs as well as inhibition of neovascularization. We observed that E4G10 administration resulted in simultaneous beneficial effects on GVHD and tumor growth leading to survival benefit of tumor bearing allo-BMT recipients. Therapeutic targeting of neovascularization in allo-BMT recipients is a novel strategy to simultaneously ameliorate GVHD and inhibit post-transplant tumor growth, providing a new approach to improve the overall outcome of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.