Detection, characterization and survival of Bacillus cereus group members in spices and herbs

Abstract

The Gram positive spore forming bacterium B. cereus can cause foodborne diseases with diarrhoeal and emetic symptoms. Spices and herbs have frequently been found to contain spores of B. cereus group species which has been linked to several foodborne disease outbreaks. The spice market is growing and a considerable part of condiments is used in the industrial food production and in the catering sector. Thus, spices and herbs can act as a vehicle to transfer B. cereus spores to various foodstuffs that might enable germination and growth under temperature abuse conditions. The informative value of standard microbiological methods applied to spices and herbs is limited as they can be biased by a high microbial background flora and possible antimicrobial effects. Moreover, they neither provide information on the exact B. cereus group species nor on the toxinogenic potential. Hence, data on these parameters are scarce for presumptive B. cereus isolated from spices and herbs. To facilitate data gathering culture independent detection and characterization methods should be developed. In this work a multiplex real- time PCR for the quantification of spores of B. cereus group species with simultaneous discrimination of B. pseudomycoides, cry1-positive B. thuringiensis as well as B. weihenstephanensis/B. mycoides was applied to artificially contaminated spices and herbs. For this, an internal amplification control was included in the PCR-method and different DNA- extraction procedures were evaluated. The best results with pure spore suspensions were achieved with the Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit coupled to quantitative real-time PCR (LOD ~10E2 cfu/ml). Yet, applied to spices and herbs kit based DNA-extraction yielded poor LODs of ≥10E5 cfu/g, whereas the open-formula CTAB-DNA-extraction achieved LODs of 10E2 to 10E3 cfu/g. In order to further investigate the pathogenic potential of B. cereus group species naturally present in spices and herbs, we analysed presumptive B. cereus strains isolated from six different condiments with presumptive B. cereus concentrations of 10E1 to 10E3 cfu/g. In a total of 59 isolates, 44 were classified as B. cereus, five as B. thuringiensis, four as B. toyonensis-like, two as B. pseudomycoides/B. mycoides one as B. weihenstephanensis, and three as undefined B. cereus group species. Most isolates carried the enterotoxin genes nheA and hblD and were also able to produce the respective toxins (Nhe and Hbl). Half of the isolates additionally harboured the cytK-2 gene. One isolate possessed the ces gene and was able to produce cereulide. For some isolates MLST analyses revealed disagreements between phylogenetic relationship and the classification as B. weihenstephanensis and B. mycoides based on previously described real-time PCR species markers (motB and bpm sequences). Hence, the suitability of these markers for species differentiation should be further investigated. For the purpose to investigate the long-term survival of B. cereus and B. thuringiensis in spices and herbs, tenacity studies were conducted using artificially contaminated condiments with spores of each species. After 50 weeks of storage in the dark no significant spore reduction could be observed for either strain. Beforehand, an appropriate spiking technique for spices and herbs was investigated and the suitability of the applied cultural detection method was evaluated. Using sand as a carrier proved to be a suitable method for dry-spiking. The examination of the cultural detection method indicated that the enumeration of vegetative cells in suspensions of spices and herbs can be biased due to substances with inhibitory effect on the bacteria. In contrast, spores remained unaffected unless stored for prolonged times in condiment suspension. This finding might be relevant for cultural enrichment.

Das Gram positive sporenbildende Bakterium B. cereus kann lebensmittelbedingte Erkrankungen verursachen, die von Symptomen wie Durchfall, Übelkeit und Erbrechen geprägt sind. In Gewürzen und Kräutern wurden bisher häufig Spezies der B. cereus-Gruppe nachgewiesen, wobei deren Vorkommen bereits mit lebensmittelbedingten Krankheitsausbrüchen in Verbindung gebracht wurde. Der Gewürzmarkt wächst und ein beträchtlicher Teil der Gewürzprodukte wird in der industriellen Lebensmittelproduktion und im Gastronomiebereich eingesetzt. So können Gewürze und Kräuter als Vehikel fungieren, um B. cereus Sporen auf verschiedene Lebensmittel zu übertragen, in welchen sie bei Nicht-einhalten der optimalen Lagertemperaturen keimen und wachsen können. Der Aussagewert von kulturellen mikrobiologischen Methoden, die an Gewürzen und Kräutern angewendet werden, ist begrenzt, da sie durch eine hohe mikrobielle Begleitflora und mögliche antimikrobielle Effekte beeinflusst werden. Darüber hinaus liefern sie weder Informationen über die exakte B. cereus- Gruppenspezies noch über die Toxinbildungs-fähigkeit. Daher fehlen Daten über diese Parameter für präsumtive B. cereus aus Gewürzen und Kräutern. Um solche Daten einfacher erfassen zu können, sind kulturunabhängige Detektions- und Charakterisierungsmethoden erstrebenswert. In dieser Arbeit wurde eine Multiplex Real-Time PCR eingesetzt, um Sporen von Mitgliedern der B. cereus- Gruppe in künstlich kontaminierten Kräutern und Gewürzen zu quantifizieren und gleichzeitig B. pseudomycoides, cry1-positive B. thuringiensis sowie B. weihenstephanensis/B. mycoides von B. cereus zu unterscheiden. Dazu wurde eine interne Amplifikationskontrolle in die PCR-Methode integriert und verschiedene DNA-Extraktionsverfahren untersucht. Die besten Ergebnisse mit reinen Sporen- Suspensionen wurden mit dem Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit gekoppelt mit quantitativer Real-Time PCR erzielt (Detektionslimit ~10E2 KbE/ml). Für die mikrobielle DNA-Extraktion aus Gewürzen und Kräutern erwies sich die Kit- basierte DNA-Extraktion jedoch als ungeeignet (Nachweisgrenzen von ≥10E5 KbE/g), wohingegen mit der CTAB-DNA-Extraktion Nachweisgrenzen von 10E2 bis 10E3 KbE/g erreicht wurden. Um das pathogene Potenzial von präsumtiven B. cereus aus Kräutern und Gewürzen zu untersuchen, wurden Stämme aus verschiedenen Gewürzprodukten, mit präsumtiven B. cereus-Gehalten von 10E1 - 10E3 KbE/g, isoliert und näher charakterisiert. Von insgesamt 59 Isolaten wurden 44 als B. cereus, fünf als B. thuringiensis, vier als B. toyonensis- ähnlich, zwei als B. pseudomycoides/B. mycoides, eins als B. weihenstephanensis und drei als undefinierte B. cereus-Gruppenspezies klassifiziert. Fast alle Isolate trugen die Enterotoxin-Gene nheA und hblD und konnten auch die entsprechenden Toxine (Nhe und Hbl) produzieren. Die Hälfte der Stämme enthielt zusätzlich das cytK-2-Gen. Ein Stamm besaß das ces-Gen und konnte Cereulid produzieren. Für einige Isolate zeigten die MLST-Analysen Widersprüche zwischen phylogenetischer Einordnung und der Klassifikation als B. weihenstephanensis und B. mycoides, basierend auf zuvor beschriebenen Real- Time PCR-Speziesmarkern (motB und bpm Sequenzen). Die Eignung dieser Marker zur Speziesabgrenzung sollte daher in weiteren Studien genauer untersucht werden. Mit dem Ziel das Langzeitüberleben von B. cereus und B. thuringiensis in Gewürzen und Kräutern zu untersuchen, wurden Tenazitätsstudien mit Sporen dieser Spezies in verschiedenen Gewürzprodukten durchgeführt. Nach 50-wöchiger Lagerung konnte bei keiner Spezies eine signifikante Sporenreduktion beobachtet werden. Im Vorfeld wurde eine zweckmäßige Spiking-Technik für Gewürze etabliert und die Eignung der angewandten kulturellen Detektionsmethode überprüft. Die Verwendung von Sand als Träger erwies sich als eine geeignete Methode zum Trocken-Spiken. Bei der Überprüfung der kulturellen Nachweismethode stellte sich heraus, dass die Quantifizierung von vegetativen Zellen in Gewürzen und Kräutern aufgrund von antimikrobiellen Substanzen in der Erstverdünnung beeinflusst sein kann. Im Gegensatz dazu zeigte sich kein Effekt auf den Nachweis von Sporen, wenn sie nicht für längere Zeiträume der Gewürzsuspension ausgesetzt waren, wie dies beispielsweise bei Anreicherungen der Fall wäre.