Analyse der Auswirkungen mechanischer Stimulation auf die enchondrale Knochenentwicklung in einem in vitro Organkulturmodell muriner fetaler Metatarsalknochen

Abstract

Die Entwicklung von Knochen und deren Homöostase werden stark durch das lokale biomechanische Umfeld beeinflusst. Diese Tatsache gilt sowohl für das adulte als auch das fetale Skelettsystem. Adulte Knochen werden ständig durch Bewegung und Einwirkung von äußeren Kräften mechanischen Belastungen ausgesetzt und passen sich diesen Umständen durch Knochenzubildung oder Abbauvorgänge an. Unterbindet man die muskuläre Aktivität von Feten in utero, resultiert dieses in verminderter Osteogenese und Osteoporose. Auch bei der Frakturheilung wurde festgestellt, dass eine direkte Knochenvereinigung und Ruhigstellung zu einer langen Heilungsphase mit Abbau von Knochensubstanz und Osteoporose führen kann. Die enchondrale Ossifikation stellt mit den Abläufen der Knorpelzellproliferation, Hypertrophie und Mineralisierung des Gewebes das verbindende Glied zwischen der Frakturheilung und der fetalen Knochengenese dar. Diese Gemeinsamkeiten ermöglichen Untersuchungen von Abläufen auf Zellebene der Osteogenese in fetaler Organkultur. Studien zeigen, dass veränderte biomechanische Belastung die Knorpel- und Knochenzellproliferation und -differenzierung während der fetalen enchondralen Ossifikation beeinflussen können. In dieser Studie wurde der Effekt der mechanischen Stimulation auf die fetalen Metatarsalia hinsichtlich Knorpelzelldifferenzierung, Mineralisierung der Matrix und Ausbildung des periostalen Knochensaums getestet. Laut Arbeitshypothese wurden eine gesteigerte Mineralisierung der Knorpelmatrix und Knochenzellaktivität erwartet. Die murinen fetalen Metatarsalia wurden zum Zeitpunkt 17,5 Tage nach Befruchtung als „en-bloc“-Präparat entnommen und über sieben Tage auf einem Filter kultiviert. Nach einem Tag Anheftung wurde täglich in Intervallen eine Drei-Punkt-Biegung durchgeführt. Die stimulierten Präparate der rechten Metatarsalia und die als Kontrolle dienenden linken befanden sich in einer zu diesem Zweck konstruierten Stimulationseinheit, die unter Organkulturbedingungen inkubiert wurde. Die Kraft der durchgeführten Biegung betrug 1000 Microstrain bei einer Frequenz von einem Hertz und es wurde in Intervallen von zwei- vier- und zwölfmal 20 Minuten am Tag stimuliert. Die in Paraffin eingebetteten Knochenanlagen wurden histologisch und histomorphometrisch analysiert. Die Auswertung erfolgte vergleichend zwischen Stimulation und Kontrolle. Während der histologischen Betrachtung zeigte sich ein gesundes normales Erscheinungsbild der Knochenanlagen, ohne dass eine Differenz zwischen Stimulation und Kontrolle sichtbar war. Allerdings zeigten sich große individuelle Unterschiede zwischen den Feten, die vor allem die Ausprägung einer primären Markhöhle betrafen. Histomorphometrische Auswertungen ergaben eine unveränderte Gesamtlänge der Metatarsalia. Die gemessenen Flächen der hypertrophen und kalzifizierten Zonen waren ebenfalls nicht signifikant unterschiedlich und auch die Länge des periostalen Saums hatte sich durch die Einwirkung der mechanischen Stimulation nicht verändert. Um eine indirekte Einwirkung auf die Kontrollen auszuschließen, wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, indem die Kontrollen in einer separaten Kulturschale untergebracht waren. Auch dieser Versuchsaufbau zeigte in seinen Ergebnissen keine Resultate, die auf einen Unterschied zwischen Stimulation und Kontrolle hindeuten. Die Ergebnisse zeigten, dass dieser Versuchsaufbau zur mechanischen Stimulation nicht zu einer gesteigerten enchondralen Ossifikation in fetalen Metatarsalia führte. Da die verwendete Kraft der Biegung zu keiner Beeinflussung der Verknöcherung geführt hat, könnte diese Kraft in zukünftigen Experimenten gesteigert oder verringert werden. Ebenso könnte die Verwendung von Feten jünger als 17,5 dpc die Messungen hinsichtlich des Auftretens einer Markhöhle einheitlicher gestalten und eventuell dadurch entstandene Fehler ausräumen.

The musculoskeletal system of vertebrates responds to the mechanical conditions during development, maintenance and repair processes. The underlying mechanisms are involved in embryonic endochondral ossification and also in postnatal bone growth and fracture healing, suggesting that these processes are controlled by similar mechanisms. The similar process in endochondral ossification interlinks embryonic development with fracture healing. It follows a basic sequence of events involving the stages of chondrocyte proliferation, chondrocyte hypertrophy, mineralization and resorption of the cartilage matrix and ultimately bone formation. Several studies have suggested that biomechanical forces influence endochondral ossification. Paralysis of muscles in embryos diminished growth of the skeleton whereas mechanical stimulation in cell and organ culture systems stimulates hypertrophy of chondrocytes and the mineralization process. This study investigated the effects of three-point bending of murine fetal metatarsal bone anlagen in vitro on cartilage differentiation, matrix mineralization and bone collar formation. It was hypothesized that cartilage calcification and bone cell activity are enhanced by mechanical bending. Metatarsal preparations of fetuses day 17.5 gestational age were dissected en bloc and cultured for seven days. After one day in culture to allow adherence to underlying filter they were stimulated six days for 20 minutes two, four or twelve times daily by bending of approximately 1000 microstrain at one Hz. The paraffin embedded bone sections were analyzed using histological and histomorphometrical techniques. Analysis was performed on the right specimen which was stimulated and compared to the left one, which served as control. Histological analysis revealed a healthy appearance of all analyzed bone anlagen and no differences between stimulated and control groups. Some differences between the individual fetuses concerning an appearance of a primordial bone marrow cavity were found. Histomorphometrical analysis of the specimen demonstrated no enhanced length of the bone anlagen and showed no effect as to the areas of hypertrophic and mineralized zones and the length of the periostal bone collar. To investigate if there might be an indirect effect of bending on the control bones, further experiments were performed by keeping the controls in a different culture plate than the experimental bones. However, both experiments illustrated very inconsistent effects of the mechanical stimulation. There might be the possibility of influencing the endochondral ossification by using enhanced or decreased microstrains or applying loads to younger bone anlagen.