Interaktionspartner der alpha-Untereinheit des stimulatorischen G-Proteins, G(alpha)s

Abstract

Die alpha-Untereinheit des stimulatorischen G-Proteins, G(alpha)s, nimmt eine zentrale Stellung in der zellulären Signaltransduktion ein. G(alpha)s ist ein Transmitter zwischen einer Vielzahl von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und dem Effektor Adenylylcyclase (AC) und stimuliert die Produktion des sekundären Botenstoffs cAMP. Im Gegensatz zu anderen G-Proteinen sind neben der AC nur wenige weitere Effektoren und keine Regulatoren der G(alpha)s-Aktivität bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden daher neue Interaktionspartner des G(alpha)s über direkte Protein-Protein- Wechselwirkungen charakterisiert. Dafür wurden zwei auf Affinitätsreinigung basierende Methoden verwendet, mit denen das Köderprotein G(alpha)s zusammen mit gebundenen Interaktionspartnern aus Säugerzell-Lysaten isoliert wurde. Die isolierten Proteinkomplexe wurden über SDS-Gelelektrophorese und anschließende Massenspektrometrie analysiert. Für die funktionelle Charakterisierung der Wechselwirkung von G(alpha)s mit bisher unbekannten Interaktionspartnern wurde rekombinantes G(alpha)s eingesetzt. Murine Orthologe konnten jedoch im Gegensatz zu bovinem G(alpha)s weder in wildtypischer Form noch unter Verwendung von C-terminalen und internen His6-Epitopen in ausreichenden Mengen exprimiert und gereinigt werden. Für die funktionelle Charakterisierung der Interaktionspartner wurde daher C-terminal His6-markiertes bovines G(alpha)s verwendet. Das Maus-Orthologe eines kurz vor Beginn der Arbeit erstmals beschriebenen humanen Regulators der G(alpha)s-Aktivität, humanem RGS-PX1, wurde näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass die G(alpha)s-Aktivität weder durch murines RGS-PX1 noch humanes RGS-PX1 beeinflußt wird, so dass RGS-PX1 nicht als Regulator der G(alpha)s-Aktivität angesehen werden kann. Bei der Suche nach neuen G(alpha)s-Interaktionspartnern wurden 10 mit inaktivem G(alpha)s und 29 mit aktiviertem G(alpha)s interagierende Proteine identifiziert, unter anderem Calmodulin, 14-3-3(beta), 14-3-3(gamma) und 14-3-3(zeta) sowie G(gamma)10 und G(gamma)12, deren Wechselwirkung mit G(alpha)s näher charakterisiert wurde. Eine Wechselwirkung von G(alpha)s mit 14-3-3-Proteinen wurde nicht bestätigt. Calmodulin wurde durch reziproke Ko- Reinigungen isolierter Proteine als G(alpha)s-Interaktionspartner bestätigt. Ein Einfluß von Calmodulin auf die G(alpha)s-katalysierte GTP-Hydrolyse konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion von G(alpha)s mit G(gamma)10 und G(gamma)12 wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals in vitro durch Ko- Reinigung der heterolog in Insektenzellen exprimierten Proteine gezeigt und bietet einen wertvollen Ansatz für zukünftige Untersuchungen zu alternativer, nicht-plasmamembranständiger Signaltransduktion des G(alpha)s.

The alpha-subunit of the stimulatory G protein, G(alpha)s, plays a central role in cellular signal transduction. G(alpha)s acts as a transmitter between a number of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the effector enzyme adenylyl cyclase (AC) thereby stimulating the production of the second messenger cAMP. As opposed to other G proteins, few effectors other than AC and no regulators of G(alpha)s activity are known to date. In the present study, direct protein-protein interactions of G(alpha)s and novel partners were characterized. Therefore, two methods based on affinity purification were used to isolate the bait protein G(alpha)s together with bound partners from mammalian cell lysates. The isolated protein complexes were analyzed using SDS-gel electrophoresis and mass spectrometry. For the functional characterization of its interaction with novel unknown partners in vitro, recombinant G(alpha)s was used. Unlike bovine G(alpha)s, neither wild type nor C-terminally or internally affinity tagged murine G(alpha)s orthologs could be recovered in sufficient amounts. Therefore, the functional characterization of novel interactors was performed using C-terminally His6 tagged bovine G(alpha)s. Recently, human RGS-PX1 was described as a novel regulator of G(alpha)s activity and therefore, the mouse ortholog was characterized in detail. In functional assays it was demonstrated that neither the mouse nor the human ortholog affects G(alpha)s activity, therefore RGS-PX1 can not be regarded a regulator of G(alpha)s activity. Using the affinity purification methods, 10 specific interactors for inactive G(alpha)s and 29 specific interactors for activated G(alpha)s were identified. Of these proteins, calmodulin, 14-3-3(beta), 14-3-3(gamma) and 14-3-3(zeta) as well as G(gamma)10 and G(gamma)12 were further characterized with regard to their interaction with G(alpha)s. The interaction of G(alpha)s and the 14-3-3-isoforms was not confirmed. Calmodulin was confirmed as a G(alpha)s-interacting protein by means of reciprocal co-purification of the isolated proteins. A functional influence of calmodulin on G(alpha)s-catalysed GTP hydrolysis was not detected. In this study, the interaction of G(alpha)s with G(gamma)10 and G(gamma)12 was demonstrated for the first time by co-purification of these proteins from insect cells where they were heterologously expressed. This provides a valuable basis for future characterization of alternate, non- plasmamembrane localized G(gamma)s signal transduction.