Characterization of Tmem128 – An activity regulated ER protein, interacting with the immediate early gene Arc/Arg3.1

Abstract

Arc/Arg3.1 is highly and transiently expressed following activity-inducing stimuli that produce synaptic plasticity. Its mRNA is actively transported into those dendritic branches with a history of recent activity. Arc/Arg3.1 knockout mice show a severe deficit in the consolidation of neuronal plasticity and long-term memories whereas synaptic transmission and the formation of short-term memory are unaffected. Previously described interaction partners of Arc/Arg3.1 suggest a role for Arc/Arg3.1 in endocytosis and intracellular sorting of neuronal transmembrane proteins. Specifically, Arc/Arg3.1 has been implicated in activity-dependent changes of AMPA-type glutamate receptor levels in the postsynaptic membrane, a mechanism considered important for different forms of synaptic plasticity. More recently Arc/Arg3.1 has also been identified to regulate activity-dependent trafficking of Presenilin1, a component of the gamma-secretase complex that plays an important role in neuronal development, synaptic plasticity and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Mechanistically, however, it is still unclear how Arc/Arg3.1 influences intracellular trafficking. Since many of the functions of Arc/Arg3.1 involve membrane dynamics or transmembrane proteins like AMPA receptors and Presenilin1, I searched for membrane bound and transmembrane interaction partners of Arc/Arg3.1. Using a Split-Ubiquitin Yeast-2-Hybrid screen I identified RIP5 and Tmem128, two so far uncharacterized multiple-pass transmembrane proteins. I confirmed their interaction with Arc/Arg3.1 in additional experiments and determined the topology of RIP5 and Tmem128 within the ER membrane. In cultured neurons RIP5 and Tmem128 are localized to the endoplasmic reticulum (ER) and are also found to colocalize with Arc/Arg3.1 and PSD95 in a subset of spines. Using northern blot analysis and in situ hybridization I could demonstrate the expression of both genes in a variety of tissues and brain regions. Moreover, I generated an antibody against Tmem128 and used this to show that the protein is expressed in the hippocampus, the cerebellum and the cerebral cortex. Furthermore, Tmem128 expression is high in brains of neonate mice and decreases during adolescence. I used genomic analysis and RT-PCR to show that Tmem128 is alternatively spliced and that neurons express two mRNAs which encode an identical Tmem128 protein but harbor mutually exclusive 3’-UTRs. The use of individual exons as 3’UTRs has so far not been described in the literature and its biological significance is likely of regulatory nature. In accordance with that, the longer splice variant is induced by synaptic activity in cultured hippocampal neurons and in the hippocampus of mice and it is accompanied by increased protein levels of Tmem128. To gain further functional insight I generated Tmem128 knockout mice. These animals are overall healthy and showed no gross alterations in brain morphology as well as neuronal ER distribution. Furthermore, knockout animals showed normal expression levels of glial and interneuron markers as well as glutamate receptors in whole brain lysates and crude synaptic membranes. Given the inducible expression of Tmem128, future experiments in the knockout mice will address the role of Tmem128 in activity- induced neuronal processes, many of which are directly or indirectly dependent on the endoplasmic reticulum.

Aktivitätsinduzierende Stimuli, die synaptische Plastizität auslösen, sorgen für einen starken und transienten Anstieg in der Expression von Arc/Arg3.1. Die Arc/Arg3.1 mRNA wird dabei aktiv in die dendritischen Regionen transportiert, die dieser Aktivität ausgesetzt waren. Mäuse mit einer genetischen Deletion von Arc/Arg3.1 zeigen schwere Störungen in der Konsolidierung von synaptischer Plastizität und im Langzeitgedächtnis, während grundlegende synaptische Transmission und das Kurzzeitgedächtnis intakt sind. Beschriebene Interaktionspartner von Arc/Arg3.1 legen nahe, dass Arc/Arg3.1 an der Endozytose und intrazellulären Sortierung von neuronalen Transmembranproteinen beteiligt ist. Im Speziellen wurde Arc/Arg3.1 mit aktivitätsabhängigen Änderungen der Oberflächenexpression von Glutamatrezeptoren des AMPA Typs in Verbindung gebracht, ein Mechanismus, der für verschiedene Formen der synaptischen Plastizität wichtig ist. Kürzlich wurde auch gezeigt, dass Arc/Arg3.1 die aktivitätsabhängige intrazelluläre Sortierung von Presenilin1 reguliert, einer Komponente des gamma-Sekretase Komplexes, der eine Rolle in neuronaler Entwicklung spielt, sowie bei synaptischer Plastizität und der Pathogenese von Morbus Alzheimer. Über welche Mechanismen Arc/Arg3.1 diese intrazellulären Sortierungsprozesse beeinflusst, ist noch immer unklar. Da die beschriebenen Funktionen von Arc/Arg3.1 Membrandynamiken beeinflussen und Transmembranproteine wie AMPA Rezeptoren und Presenilin mit einschließen, habe ich spezifisch nach membran-assoziierten neuen Interaktionspartnern für Arc/Arg3.1 gesucht. Unter Verwendung des Split- Ubiquitin Hefe-2-Hybrid Systems konnte ich RIP5 und Tmem128, zwei bis jetzt nicht charakterisierte Transmembranproteine, identifizieren. Ich habe die Interaktion dieser Proteine mit Arc/Arg3.1 in weiteren Experimenten bestätigen können und ihre Topologie innerhalb der ER Membran bestimmt. In kultivierten Neuronen sind RIP5 und Tmem128 im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zu finden, sowie kolokalisiert mit Arc/Arg3.1 und PSD95 in einer Fraktion dendritischer Dornenfortsätze. Northern Blots und in situ Hybridisierungen ergaben, dass beide Gene in verschiedenen Geweben und Hirnregionen der Maus exprimiert werden. Zudem habe ich einen Antikörper gegen Tmem128 generiert, mit dem ich die Expression des Proteins in Hippokampus, Kleinhirn und Großhirnrinde bestätigen konnte. Entwicklungsabhängig ist die Expression von Tmem128 in den Gehirnen neugeborener Mäuse stark und nimmt im Laufe der ersten Lebenswochen ab. Darüber hinaus ergaben Genomanalyse und RT-PCRs, dass Tmem128 in Neuronen alternativ gespleißt wird. Beide mRNAs kodieren für das gleiche Protein, enthalten aber sich gegenseitig ausschließende 3’UTRs. Die Verwendung eigenständiger Exons für alternative 3‘UTRs wurde bislang noch nicht beschrieben, ist jedoch vermutlich für die Regulation der Expression bedeutsam. Dies scheint auch für Tmem128 der Fall zu sein, da selektiv die längere der beiden Varianten durch synaptische Aktivität induziert wird. Dies konnte ich sowohl in kultivierten hippokampalen Neuronen als auch im intakten Hippokampus der Maus zeigen. Zusätzlich konnte ich die aktivitätsabhängige Induktion von Tmem128 im Hippokampus der Maus auf Proteinebene bestätigen. Zur weiteren Charakterisierung der Proteinfunktion habe ich Tmem128 knockout-Mäuse generiert. Die genetisch veränderten Mäuse zeigen eine normale postnatale Entwicklung und keine Veränderungen in ihrer makroskopischen Gehirnanatomie sowie der Morphologie des neuronalen ER. Zudem exprimieren die knockout-Mäuse normale Level von Gliazell- und Interneuron-Markern sowie von Glutamatrezeptoren, soweit dies in Hirnlysaten und isolierten synaptischen Membranfraktionen erkennbar ist. Im Hinblick auf die induzierbare Expression von Tmem128 werden zukünftige Untersuchungen in den knockout-Mäusen die Funktion dieses Proteins in aktivitätsinduzierten neuronalen Prozessen untersuchen, von denen viele direkt oder indirekt vom endoplasmatischen Retikulum abhängen.