Microglia are the central nervous system´s (CNS) resident macrophages. The myeloid progenitors that determine the microglial lineage colonize the CNS in the early embryonic life and serve thereafter the local innate immunity. In the immune privileged CNS, microglial innate immune functions are constitutively suppressed (‘resting’). Activation of microglial innate immune functions, such as direct cytotoxicity, antigen presentation, sequestration and stimulation of lymphocytes and phagocytosis, has been associated with reduction of the ‘resting/surveying’ ramified morphology and somatic transition to a round, ‘ameboid’ shape. Microglial activation is a pathologic hallmark in many CNS diseases and a common finding in in vitro neurodegeneration models. However, the causality underlying the correlation between microglial activation and neurodegeneration is currently debated. In this study we used the organotypic hippocampal slice culture as a model to investigate the impact of microglial activation on neuronal function and survival. After exposure of organotypic slices to the purified bacterial endotoxin lipopolysaccharide (LPS), for 72 hours, the microglial activation was quantified by assaying the supernatant for nitrite production, as well as for the proinflammatory cytokines interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNF-α). By applying anti-Iba1 immunohistochemistry and quantitative morphological methods (stereology and Neurolucida® tracings) we additionally described the microglial population in terms of size and ramification pattern. Standard histochemical and immunohistochemical staining (toluidine blue, NeuN) in combination with the specific neurodegeneration marker Fluoro-Jade B® were used to quantify neurodegeneration. The impact of microglial activation on neuronal function was assessed in the CA1 hippocampal subregion by extracellular electrophysiological measurements of the spontaneous (multiunit activity and local field potential) and evoked field activity (input-output properties and short88 term plasticity). Moreover, by studying stimulation- evoked potassium ([K+]o) transients with ion-sensitive microelectrodes we probed the homeostatic capacity of the local neuro-glial network. Our results show that the LPS-triggered microglial activation did not result to neurodegeneration. Furthermore, minimal changes in the electrophysiological field activity and [K+]o transients argue against a fundamental perturbation of the neuronal and astroglial function. The absence of neuronal death after LPS exposure in organotypic slice cultures, in sharp contrast to the severe degeneration occurring in vivo and in primary cultures, suggests that microglial activation is not necessarily neurotoxic and toxicity may occur in a context-dependent manner. With the present study we have established a model to further investigate the factors that may link microglial activation with neurotoxicity.
Die Mikroglia-Zellen sind die Makrophagen des zentralen Nervensystem. Deren Myeloid Vorläuferzellen wandern während der frühen Embryogenese in das zentrale Nervensystem (ZNS) ein und vermitteln dort die angeborene Immunität, die im ZNS unter normalen Bedingungen konstitutiv unterdrückt ist. Demzufolge, befinden sich die Mikrogliazellen in einem „Ruhezustand. Der Übergang zum aktiven Status der Mikrogliazellen, ausgelöst z.B. durch Zelltoxizität, Antigenpräsentation, Lymphozytenstimulation oder Phagozytose führt zu einer bemerkenswerten Veränderung der Zellmorphologie: Die weitverzweigte Erscheinung der ruhenden/beobachtenden Zellen wird durch ein eher „amöboides“ Erscheinungsbild des Zellkörpers ersetzt. Dieser Aktivierungsprozess ist nicht nur ein auffälliges Erscheinungsbild vieler pathologischer Zustände des ZNS, sondern lässt sich auch in diversen in vitro Modellen neurodegenerativer Krankheiten beobachten. Dies legt einen kausalen Zusammenhang zwischen Aktivierung und pathologischer Manifestation nahe, ohne dass diese allerdings zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte. Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Mikrogliazellenaktivierung auf neuronale Zellen und ihr Überleben untersucht. Inkubation mit dem bakteriellen Endotoxin (Lipopolysaccharide, LPS) für 72 Stunden führte zu einer verlässlichen und reproduzierbaren Aktivierung der Mikrogliazellen. Dies konnte durch Quantifizierung des Nitritgehalts im Überstand, der entzündungsfördernden Interleukine IL-6 und des Tumornecrosis factors α (TNF-α) belegt werden. Eine detaillierte Analyse der Mikroglia- Morphologie wurde durch immunohistochemische und stereologische Methoden durchgeführt, mit einem Schwerpunkt auf Zellkörpergröße und Verzweigungsgrad. Diese Parameter, die den Aktivierungsgrad der Mikrogliazellen charakterisieren, wurden mit verschiedenen, histo- und immunzytochemischen Markern (toluidine blue, NeuN) des Zellüberlebens und solchen spezifisch für Neurodegeneration (Fluoro-Jade B®) korreliert. Unabhängig vom Überleben der Nervenzellen, wurde auch deren Funktion nach Mikrogliaaktivierung untersucht. Dazu wurden in der hippokampalen CA1 Region extrazelluläre elektrophysiologische Ableitungen durchgeführt, die Aufschlüsse über spontanes und evoziertes Verhalten (multiunit activity, evoked and spontaneous local field potential, Kurzzeitplastizität) geben. Darüber hinaus wurde auch die homeostatische Regulation der extrazellulären Kaliumkonzentration mit ionensensitiven Elektroden charakterisiert. In dieser Studie wurden neurodegenerative Vorgänge nicht von LPS-induzierter Mikrogliaaktivierung beeinflusst. Darüber hinaus wiesen auch die elektrophysiologischen und ionensensitiven Messungen nicht auf eine grundlegende Veränderung der neuronalen und astrogliären Funktionen hin, sondern enthüllten nur geringfügige Veränderungen. Diese Resultate widersprechen bisherigen Erkenntnissen aus in vivo und Primärkulturexperimenten. Eine mögliche Interpretation der Daten stellte daher keinen zwangsläufigen kausalen Zusammenhang zwischen Mikrogliazellenaktivierung und Neurotoxizität her; ein solcher Zusammenhang könnte aber im hohen Maße kontextabhängig und nicht kanonisch sein. Um solche kontextabhängigen Zusammenhänge aufzuklären, ist das in dieser Arbeit etablierte experimentelle Modell hervorragend geeignet.
