Untersuchung des Sensibilisierungspotenzials von ungesättigten Verbindungen im Loose-fit Coculture-based Sensitization Assay (LCSA)

Abstract

Für die Identifizierung von potenziellen Kontaktallergenen stellten tierexperimentelle Methoden, wie der an Mäusen durchgeführte Local Lymph Node Assay (LLNA), lange Zeit den Standard dar. Die Abkehr von Tierversuchen für toxikologische Untersuchungen hat zur Entwicklung zahlreicher in vitro- Testmethoden geführt. Der „loose-fit coculture-based sensitization assay“ (LCSA) beruht auf einer Kokultur von Keratinozyten und dendritischen Zellen. In dieser Arbeit wurden Substanzen mit ungesättigten Kohlenstoffverbindungen mit dem LCSA untersucht, um mehr Wissen über die Aussagekraft des LCSA zu erhalten. Nach Anlage der Kokultur wurden die Testsubstanzen Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Octinol, Squalen, sowie die ungesättigten Fettsäuren Arachidonsäure, Linolsäure, Linolensäure, Ölsäure und Undecylensäure zugegeben. Mittels Durchflusszytometrie wurden die Ausprägung des Oberflächenmarkers CD86 und die Vitalität der Zellen gemessen. Zum Vergleich des sensibilisierenden Potenzials dient die mittlere effektive Konzentration (EC50). Arachidonsäure, Linolsäure, Linolensäure und Ölsäure benötigten die geringsten Konzentrationen zur Induktion von CD86 (EC50: 2-10 µmol/L), gefolgt von Undecylensäure (EC50: 247 µmol/L). Octinol und Maleinsäure induzierten CD86 erst bei hohen Konzentrationen (EC50: 1002 bzw. 1983 µmol/L). Bei Bernsteinsäure und Fumarsäure konnte kein signifikanter und reproduzierbarer Anstieg von CD86 beobachtet werden. Die Untersuchung von Squalen war aufgrund mangelnder Löslichkeit im Medium der Kokultur nicht möglich. Es liegen keine sonstigen Hinweise auf kontaktallergisches Sensibilisierungspotenzial durch Arachidonsäure, Linolsäure, Linolensäure und Ölsäure vor, so dass von falsch- positiven Ergebnissen im LCSA ausgegangen wird. Die immunmodulierende Wirkung von ungesättigten Fettsäuren ist bekannt und basiert vermutlich auf der Umwandlung in Eicosanoide, der Veränderung der Zellmembranen, sowie der Beeinflussung der Genexpression durch Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren (PPAR). Wenn nur Substanzen mit einem EC50 unter 1000 µmol/L als positive Ergebnisse gewertet werden, stimmen die Ergebnisse bis auf die ungesättigten Fettsäuren mit denen im Guinea Pig Maximization Test (GPMT) überein. Die Ergebnisse aus dem LLNA für die ungesättigten Fettsäuren einschließlich Undecylensäure, sowie Bernsteinsäure und Fumarsäure sind vergleichbar. Während Octinol und Maleinsäure im LLNA eine deutliche Reaktion der Lymphknoten auslösten, konnte im LCSA keine vergleichbare Wirkung gezeigt werden. Da diese Substanzen auch im GPMT negativ waren, handelt es sich hierbei vermutlich um falsch-positive Ergebnisse des LLNA. Insgesamt erweist sich der LCSA als zuverlässige Methode, so dass eine weitere Evaluation der Tauglichkeit als Sensibilisierungstest angestrebt werden sollte.

Identification of skin sensitizers has traditionally been performed using animal-based methods like the murine local lymph node assay (LLNA). The recent movement away from animal models for toxicological research has led to the development of a multitude of in vitro methods. This research project has studied unsaturated compounds using the loose-fit coculture-based sensitization assay (LCSA), an assay based on a combination of keratinocytes and dendritic cells, in order to assess the performance of the test method. After establishing the coculture, the substances fumaric acid, maleic acid, octinol, squalene, succinic acid, as well as the unsaturated fatty acids arachidonic acid, linoleic acid, linolenic acid, oleic acid, and undecylenic acid were added. The expression of the surface marker CD86 and the cell vitality were measured using flow cytometry. The sensitizing potentials were compared using the half maximal effective concentrations (EC50). Arachidonic acid, linoleic acid, linolenic acid, and oleic acid induced expression of CD86 at the lowest concentrations (EC50: 2-10 µmol/L), followed by undecylenic acid (EC50: 247 µmol/L). Octinol and maleic acid stimulated CD86 only at higher concentrations (EC50: 1002 and 1983 µmol/L, respectively). Fumaric acid and succinic acid did not induce a significant and reproducible induction of CD86. Squalene was not soluable in the medium. Arachidonic acid, linoleic acid, linolenic acid and oleic acid appear to produce false-positive results, considering that there are no reports of sensitizations. Unsaturated fatty acids have known immunomodulating properties, thought to involve conversion into eicosanoids, modulation of the cellular membranes, as well as effects on the gene expression through peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR). The results of the LCSA are compatible with those obtained by the guinea pig maximization test (GPMT), except for oleic acid, if only substances achieving an EC50 below 1000 µmol/L are considered to be positive. The LLNA, on the other hand, demonstrated results similar to those in the LCSA for the unsaturated fatty acids, as well as fumaric acid and succinic acid. Maleic acid and octinol, however, led to high stimulation indices in the LLNA, but no comparable effects in the LCSA. Considering that these two substances were also negative in the GPMT, the results of the LLNA might be false-positives. Overall, the LCSA appears to be a reliable method, warranting further evaluation of its performance as a sensitization assay.