Neue zellbasierte Biomarker in der automatisierten hämatologischen Labordiagnostik

Abstract

Vollautomatisierte Messverfahren haben in der Blutbildanalytik in den vergangenen Jahrzehnten das manuelle Differentialblutbild in der Laboratoriumsmedizin weitestgehend ersetzt und so neben präziseren Ergebnissen auch zu einer Reduktion der Kosten sowie zu einer deutlich schnelleren Bearbeitungszeit geführt. Durch stetig wachsende technische Fortschritte sind moderne Hämatologieautomaten in der Lage, nicht nur die Zellgruppen sämtlicher Zellreihen des menschlichen Blutes exakt zu quantifizieren und voneinander zu differenzieren, sondern auch deren „biologische Aktivität“ zu bestimmen. Dies geschieht mit Hilfe neuer zellbasierter Biomarker, von denen einige in dieser Arbeit näher charakterisiert wurden. Publikation 1 zeigte den erfolgreichen Ersatz der manuell-mikroskopischen und semiquantitativen Methode zur Untersuchung einer Blutprobe auf das Vorhandensein von toxisch granulierten neutrophilen Granulozyten durch den automatisiert bestimmten GI-Index, der mittels Fluoreszenz-Flowzytometrie in einem Hämatologieautomaten quantifiziert wird. Das vollautomatisierte Messverfahren führte nicht nur zu einer deutlichen Beschleunigung und Präzisierung der Analytik, sondern auch zu einer verbesserten Standardisierung und Objektivierung der Nachweismethode. In Publikation 2 wurden die Referenzbereiche von NEUT-GI und dem hieraus berechneten GI-Index für die neue Sysmex Hämatologiegerätegeneration XN an einem größeren Kollektiv gesunder und schwerkranker Patienten etabliert. Das Delta-He repräsentiert die Differenz im Hämoglobingehalt zwischen jungen Retikulozyten und reifen Erythrozyten. Dieser dynamische und zellbasierte Parameter ist ein vielversprechender Biomarker zur Anämiediagnostik sowie zum Therapie- und Verlaufsmonitoring entzündlicher Prozesse bis hin zur Sepsis (Publikation 3, Publikation 4 und Publikation 5). In Publikation 3 gelang der Nachweis, dass das Delta-He an einem Kollektiv schwerkranker Patienten insbesondere mit dem Abklingen einer hochgradigen Entzündung unter medizinischer Therapie eng korreliert ist. Diese Beobachtung konnte in Publikation 4 in einer Studie zum ICIS-Score bestätigt werden. Im Vergleich zu den klassischen Entzündungsmarkern CRP, Procalcitonin und periphere Gesamtleukozytenzahl erlaubte der ICIS-Score in der vorliegenden Studie das frühzeitigere Erkennen einer systemischen Infektion bei Intensivpatienten sowie den rationaleren Einsatz von Antibiotika. Publikation 5 wies die zentrale Rolle des Delta-He in der Differentialdiagnostik verschiedener Anämieformen nach. Ein zu diesem Zweck neu etablierter Häma-Plot stellt die beiden neuen und zellbasierten Biomarker Ret-He (y-Achse) und Delta-He (x-Achse) in einem neun-feldrigen Diagramm dar und ermöglicht so auf einen Blick medizinische Differentialdiagnosen, ein Therapie- und Verlaufsmonitoring sowie die Überprüfung der Patienten-Compliance und der Therapie-Suffizienz. Aufgrund der raschen Dynamik des Parameters Delta-He empfiehlt sich die Bestimmung insbesondere bei entzündlich bedingten Anämieformen (ACD bei Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, Tumoren, Sepsis). HFC können aufgrund des erhöhten Gehalts an Nukleinsäuren mit Hilfe eines Hämatologieautomaten im Blut sowie in diversen Körperflüssigkeiten valide detektiert und quantifiziert werden. In Publikation 6 wurde erstmals das entsprechende Korrelat der HFC im Liquor cerebrospinalis charakterisiert: hierbei handelte es sich zum überwiegenden Teil um intrathekale Tumorzellen. Jedoch reichte die nachgewiesene Sensitivität und Spezifität dieses neuen zellbasierten Biomarkers HFC zur sicheren Detektion von Tumorzellen im Liquor nicht aus, um auf den methodischen Goldstandard zum Nachweis einer Meningitis neoplastica, die Mikroskopie von Zytospinpräparaten, zu verzichten.

Today, fully-automated hematology analyzers have nearly replaced manual microscopy of blood smears in clinical pathological laboratories delivering quick, precise and highly standardized blood count results to the clinician. The corresponding costs and the turn-around-times have been fallen significantly, too. Modern hematology analyzers are not only able to quantify and differentiate several cell populations in blood and other body fluids, they are also capable measuring the „biological activity“ of cells. New cell- based biomarkers have been detected during the past years and some of them are characterized and portrayed in this postdoctoral lecture qualification thesis. Publication 1 demonstrated the successful replacement of manual microscopy of toxic granulated neutrophils in blood smears using fluorescence flowcytometry of an automated hematology analyzer detecting and quantifying toxic granulation of neutrophils. The results were generated quicker and more precisely compared to the manual method. Additionally, the standardization of the automated version is higher and the proof is more objective than using the microscopical technique depending on the quality of staining and the experience of the technical staff. In publication 2 we established new reference intervals for NEUT-GI and the corresponding GI-Index on the latest generation of Sysmex hematology analyzers (XN) using a large cohort of healthy and severely ill patients. Delta-He represents the difference in hemoglobin content of newly formed reticulocytes compared to mature erythrocytes. Delta- He is a cell-based dynamic biomarker for differential diagnosis of anemia as well as for therapy monitoring and compliance control during inflammatory disease and sepsis (publication 3, publication 4 and publication 5). In publication 3 we showed that Delta-He is an indicator for the resolution of a high-grade inflammation in a cohort of severely ill patients. Publication 4 confirmed these results: compared to „classical markers“ of an acute phase reaction like CRP, PCT and total leucocyte count the ICIS-Score was able to detect a systemic infection in severely ill patients earlier and it allowed a more rational application of antibiotics. Publication 5 clarified the central role of Delta-He in differential diagnosis of diverse forms of anemia. The so- called „Hema-Plot“ combines the laboratory results for Ret-He (y-axis) and Delta-He (x-axis) in a nine-bay plot enabling the clinician a diagnosis at a glance as well as the additional options for therapy monitoring and compliance control. Due to the dynamic character of Delta-He, changing its value due to therapeutical interventions already after a few hours, we suggest its measurement especially in inflammation-based diseases leading to anemia (ACD in combination with hemato-oncological or chronic-inflammatory diseases, sepsis, etc.). HFC can be detected in blood and in diverse body fluids using fluorescence-flowcytometry. The detection process is performed using a hematology analyzer quantifying the content of intracytoplasmic nucleic acids (RNA/DNA). In publication 6 we presented the morphological correlate of HFC in cerebrospinal fluid: in most cases HFC represented intrathecal tumor cells. But the sensitivity and specificity were not high enough for the certain detection of tumor cells in CSF leading to the clinical diagnosis of a „meningitis neoplastica“. Therefore, the „goldstandard“ for the detection of intrathecal tumor cells still is manual microscopy of cytospin preparations.