Untersuchungen zur geno- und phänotypischen Charakterisierung der aviär pathogenen E. coli (APEC)-Mutante M12A09, die eine Transposoninsertion im Gen pyrD trägt

Abstract

Die am hoch pathogenen APEC-Stamm IMT5155 (O2:K1:H5) durchgeführte STM von Li et al. (2005) lieferte zahlreiche Mutanten mit Defekten in Genen, die zu einem attenuierten Phänotyp im Infektionsmodell mit 5 Wochen alten Hühern führten (100, 102). In dieser Arbeit werden erstmals die Ergebnisse der geno- und phänotypischen Charakterisierung einer dieser Mutanten aufgeführt. Nach diesen Untersuchungen handelt es sich bei M12A09 um einen Abkömmling des Stammes IMT5155 mit einer Transposon-Insertion in einem Gen der de novo Biosynthese der Pyrimidine, pyrD, wie durch Multiplex-PCR, PFGE-Restriktionsmuster, DNS- DNS-Hybridisierungen und arbitrary PCR demonstriert. Durch Genexpressions- Analysen mittels reverser Transkriptase-PCR konnte die fehlende Transkription von pyrD in Hühnerserum und LB-Medium nachgewiesen werden. Die Untersuchungen zur Etablierung eines Phänotyps ergaben, dass die Mutante ohne weiteres in LB wachsen und sogar mit dem Wildtyp um die darin enthaltenen Nährstoffe konkurrieren kann. Der auxotrophe Charakter von M12A09 äußert sich jedoch in M9+ und in hitzeinaktiviertem Hühnerserum durch die fehlende und verminderte Vermehrung der Mutante. Dieses Wachstumsdefizit konnte durch externe Zufuhr von 750 µg/ml Orotat kompensiert werden. Weiterhin könnte nachgewiesen werden, dass erst durch das Wiedereinführen des intakten pyrD-Gens und eines ca. 700 bp großen Abschnitts stromaufwärts des Gens auf einem low-copy Plasmid der Phänotyp des Wildtypstammes in M9+ wieder hergestellt werden kann. Die Verwendung des Embryonen-Letalitätstests (ELA) als adäquates Medium zur Klassifizierung von Mutanten nach ihrer Pathogenität konnte in dieser Studie für die auxotrophe Mutante M12A09 nicht bestätigt werden, da die Charakterisierung der Virulenz im zuverlässigen Hühnerinfektionsmodell ergab, dass M12A09 zwar eine Infektion verursacht, allerdings deutlich milder im Vergleich zum Wildtyp. Nach den Ergebnissen des ELA ist die Mutante M12A09 jedoch als hoch pathogen einzustufen. Dies konnte im bereits etablierten Hühnerinfektionsmodell nach der intratrachealen Applikation von ca. 2,5 x 108 CFU nicht bestätigt werden. Während die Inokulation des Wildtyps zu den klassischen Anzeichen der APEC-Infektion mit hochgradig gestörtem Allgemeinbefinden, Todesfällen und typischen Organläsionen post mortem führte, zeigten sich die Tiere, die die Mutante bekamen weitgehend ungestört und die pathologische Untersuchung belegte einen abgeschwächten Infektionsprozess. Somit ist die Mutante M12A09 mit einem defekten pyrD-Gen nach dieser Studie als attenuierter Erreger einzustufen, dessen protektive Eigenschaften weiter untersucht werden sollten.

Li et al. (2005) applied STM to the highly pathogenic APEC-strain IMT5155 (O2:K1:H5) and created a large amount of attenuated mutants as demonstrated by inoculation to 5-week old chickens (100, 102). In this study we present the results of the geno- and phenotypic characterization of one of these mutants. The mutant M12A09 is a derivate of the strain IMT5155 carrying a transposon insertion in the gene pyrD, involved in the de novo pyrimidine biosynthesis, as shown by the results of multiplex PCR, DNA Hybridization and arbitrary PCR. The analysis of gene expression by applying reverse transcriptase PCR demonstrated that pyrD is neither transcribed in LB nor chicken serum when strain M12A09 is cultivated in these media. Further studies to establish a phenotype reveal that the mutant strain M12A09 displays the same growth characteristics as strain IMT5155 in LB and when grown together in this medium, the wildtype strain is not able to outcompete the mutant strain. The auxotrophic nature of pyrD mutants though, hinders strain M12A09 from growing in M9+ medium and heat inactivated chicken serum. Furthermore, we demonstrate that the addition of 750 µg/ml orotate to these media compensates the growth deficiency and that the gene pyrD together with approx. 700 bp upstream of the gene is needed to be reintroduced on a low-copy plasmid to M12A09 in order to re-establish the phenotype of strain IMT5155 in M9+ medium. We were not able to confirm that the embryo lethality assay (ELA) is an appropriate medium to classify mutants after their virulence since the results of the more reliable chicken infection model differ from those obtained by the ELA, after which M12A09 is to be categorized as higly virulent. The intratracheal application of ca. 2.5 x 108 CFUs of strain IMT5155 to 5 week old chickens releases typical symptoms of the APEC-infection, as poor general condition, death cases and gross lesions in the internal organs. In contrast, most of the animals that were inoculated with the mutant strain performed well and the pathological findings suggest that they undergo a moderate infection process. Thus, we conclude that the APEC-mutant M12A09, with a defective pyrD gene, is attenuated and its potential protectiveness should be further studied.