Die Bedeutung von P-Glykoprotein (Pgp) assoziierten Mechanismen der Resistenz gegenüber makrozyklischen Laktonen (ML) beim Pferdespulwurm Parascaris equorum

Abstract

Dem Einsatz von Anthelminthika wie den makrozyklischen Laktonen (MLs) kommt in der Tierhaltung eine bedeutende Rolle zu und ein Verlust ihrer Wirksamkeit kann neben den mit der Infektion verbundenen gesundheitlichen Beeinträchtigungen hohe wirtschaftliche Einbußen nach sich ziehen. Da mittelfristig nicht mit der Einführung neuer Antiparasitika zu rechnen ist, sollte auf den Erhalt der verfügbaren Anthelminthika ein besonderes Augenmerk gelegt werden. Die Voraussetzung hierfür ist die Kenntnis der zugrundeliegenden Resistenzmechanismen. Zu diesen ist im Fall der ML-Resistenz insbesondere die Aktivität der P-Glykoproteine (Pgps) zu zählen, die der Superfamilie der ATP-Binding-Cassette (ABC)-Transporter angehören. Die in die Membran integrierten Proteine dienen dem aktiven Transport von Molekülen und Veränderungen ihrer Struktur oder Anzahl können infolge der verminderten Verfügbarkeit am Wirkort die Effizienz eines Wirkstoffes beeinträchtigen. Bei dem zur Gruppe der MLs gehörenden Ivermectin (IVM) wurde die Eigenschaft als Pgp-Substrat bereits bei Säugerzellen nachgewiesen. IVM findet breite Anwendung bei der Behandlung parasitärer Infektionen, zu denen auch die Parascariose, eine Jungtiererkrankung der Equiden, gehört. Bei dem Erreger handelt es sich um einen Parasiten des Dünndarms, der hier zu Obstruktionen mit Todesfolge führen kann. Die Bekämpfung dieses weltweit z. T. mit hohen Prävalenzen anzutreffenden Parasiten wurde in den letzten Jahren zunehmend durch das Auftreten von Resistenzen gegenüber IVM erschwert. Die molekularen Hintergründe hierfür sind noch weitgehend ungeklärt und auch für die Diagnose resistenter Populationen sind keine Verfahren standardisiert. Aufgrund der Beobachtungen an anderen Nematoden hinsichtlich eines Zusammenhanges zwischen Pgps und der Resistenz gegenüber MLs wurden die vollständigen Sequenzen zweier putativer Pgps von P. equorum mit Hilfe degenerierter Primer und einer anschließenden RACE-PCR gewonnen. Phylogenetische Untersuchungen offenbarten diese als Orthologe von Caenorhabditis elegans Pgp-11 (PeqPgp-11) bzw. des nicht näher benannten Pgp CBG12969 von Caenorhabditis briggsae (PeqPgp-16). Die Aminosäuresequenzen beider Proteine weisen die Pgp-typischen Motive auf, die an der Substrat- und ATP-Bindung beteiligt sind. Der Vergleich einzelner Gewebe hinsichtlich ihrer Pgp-Expression mittels Real-time-RT-PCR ergab, dass die Peqpgp-11-Expression im Darm männlicher und weiblicher Individuen signifikant gegenüber den restlichen untersuchten Geweben erhöht war, wohingegen sich der Hautmuskelschlauch für Peqpgp-16 als das Gewebe der stärksten Expression erwies. Um mögliche Veränderungen, die mit der IVM- Resistenz bei P. equorum einhergehen, zu untersuchen, wurden außerdem die Pgp- Sequenzen mehrerer Populationen mit unterschiedlicher IVM-Suszeptibilität miteinander verglichen. Für PeqPgp-11 wurden im Rahmen einer SeqDoC-Analyse drei Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) ermittelt (Asp931Asn, Cys951Ser, Tyr978His), die jeweils zu einer Aminosäuresubstitution führten und mit der IVM-Suszeptibilität der Populationen korrelierten. Die quantitative Untersuchung zur Expression beider Pgps bei Eiern ließ dagegen keinen Schluss auf einen Zusammenhang mit dem Resistenzstatus zu. Als weiteres Entwicklungsstadium wurden präadulte Würmer in die Untersuchungen miteinbezogen: Eine Gruppe von Würmern mit verminderter IVMSuszeptibilität zeigte eine signifikant höhere Expression von pgp-11 gegenüber einer zufällig gewählten Gruppe. Neben diesen deskriptiven Beobachtungen an P. equorum wurde außerdem die Beteiligung der Pgps am Entgiftungsprozess bei dem Modellorganismus C. elegans untersucht, erstens, um Aussagen über den gleichzeitigen Verlust der Funktionalität sämtlicher Pgps am lebenden Organismus treffen zu können und zweitens, um die Bedeutung einzelner Pgps für den IVMTransport vergleichend darstellen zu können. IVM führte in Gegenwart des Pgp-Hemmers Verapamil zu einer geringen aber signifikanten Abnahme des EC50-Wertes (~2,5fach) gegenüber dem Wildtypstamm Bristol N2, wie sich anhand von verminderten Entwicklungsraten zeigte. Der Funktionsverlust einzelner Pgps ging dagegen mit einer Reduktion des EC50-Wertes um den Faktor 1,5-4,3 einher. Neben Pgp-14 zeigte der Verlust der pgp-11-Aktivität die größten Auswirkungen auf die Entwicklung. Die im Laufe dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sprechen für die Beteiligung der Pgps an der Resistenz gegenüber IVM bei Nematoden. Dies wird sowohl anhand der Zunahme der Suszeptibilität nach dem Funktionsverlust einzelner bzw. aller Pgps bei C. elegans deutlich, als auch durch strukturelle und quantitative Veränderungen des Proteins in Abhängigkeit vom Resistenzstatus bei P. equorum. Eine besondere Rolle spielte in beiden Fällen pgp-11, dessen SNPs bei P. equorum vielversprechende Kandidaten für die Resistenzdiagnostik darstellen. Die Beurteilung ihrer Eignung erfordert die Untersuchung weiterer Spulwurmpopulationen mit bekanntem Resistenzstatus. Um diese zu erleichtern, wurde für zwei der drei SNPs bereits erfolgreich ein Pyrosequenzierungs-Assay etabliert. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, die Bedeutung dieser SNPs durch die vergleichende heterologe Expression von Pgp-11 des suszeptiblen und des vermeintlich resistenten Genotyps in einem Modellorganismus zu ermitteln. Als solcher bietet sich aus vielerlei Hinsicht C. elegans an, u. a. auch, weil ein entsprechender pgp-11 Loss-of-function- Stamm, der die Durchführung eines Rescues erlaubt, hinsichtlich seiner IVM- Suszeptibilität schon näher charakterisiert wurde. Aus diesem Grund wurden bereits transgene Linien, die das PeqPgp-11 des vermeintlich resistenten Genotyps exprimieren, sowie eine Kontrolllinie erzeugt. Erste vergleichende Analysen zwischen diesen verschiedenen Linien führten zu vielversprechenden Ergebnissen.

Anthelmintics such as the macrocyclic lactones (MLs) are of special importance for healthcare in animal husbandry. A loss of their efficacy might cause damages of health due to infections resulting in significant adverse economic effects. As the introduction of new antiparasitics cannot be expected in the medium-term, preservation of existing effective anthelmintics should be of special interest. This requires the knowledge of underlying resistance mechanisms in parasites. ML-resistance is supposed to be a result of the activity of Pgps which belong to the ATP-binding-cassette (ABC)-superfamily of transporters. Expressed in cell-membranes, Pgps mediate the ATP-dependent transport of molecules. Therefore, changes in morphology or expression might result in reduced availability of drugs at their target-site followed by a decreased drug efficacy. The ML ivermectin (IVM) is an excellent Pgp-substrate which was demonstrated in mammalian cells. It is widely used in treatment of parasitic infections as e. g. of Parascaris equorum, affecting predominantly young equines. Adult stages of P. equorum are found in the small intestine where obstruction may lead to rupture of the intestinal wall and death. Recently, the worldwide occurrence of this nematode with its sometimes high prevalence was accompanied by cases of IVMresistance. Unfortunately, the molecular background of this process remains largely unclear and appropriate techniques for detection of ML-resistance in P. equorum are not standardised yet. In this work, complete sequences of two putative P. equorum Pgps were generated using degenerated primers and a following RACE-PCR based on observations in other nematodes concerning the contribution of Pgps in ML- resistance. By phylogenetic analysis these were identified orthologs of Caenorhabditis elegans Pgp-11 (PeqPgp-11) and an unnamed Pgp of Caenorhabditis briggsae CBG12969 (PeqPgp-16). Amino acid sequences of both proteins contained Pgp-specific motifs which are known to be involved in drug- and ATP-binding. Comparison of pgp-expression between tissues was conducted by quantitative real-time PCR. Peqpgp-11 was found to be significantly higher expressed in the gut of both genders, in contrast to Peqpgp-16 which was predominantly expressed in the body wall. In order to detect changes associated with IVM- resistance in P. equorum, Pgp-sequences of populations with different ML- susceptibility were compared. SeqDoC-analysis revealed three single nucleotide polymorphisms (SNPs) which correlated with decreased ML-susceptibility and caused a substitution of the corresponding amino acid (Asp931Asn, Cys951Ser, Tyr978His) in PeqPgp-11. No resistance associated differences in mRNA expression levels were detected between embryonated eggs of the same populations. Furthermore, pre-adult worms were included in investigations, where a group of worms with reduced IVM susceptibility showed statistically significant overexpression of Peqpgp-11 compared to a randomly selected group. Apart from these descriptive observations for P. equorum, the contribution of Pgps in detoxification was also investigated in the model nematode C. elegans, first, to analyse the consequences of general inhibition of Pgp-activity in a living organism and second, to assess the importance of single Pgps for the IVM-transport. In presence of the Pgp-inhibitor Verapamil, the EC50-value was decreased little but significantly by 2.5fold compared to the C. elegans wildtype Bristol N2 strain, which was found in terms of a reduced development rate of C. elegans. However, loss-of-function strains missing a single Pgp were hallmarked by decreased EC50-values between the 1.5- and 4.3fold. Apart from Pgp-14, loss of Pgp-11 activity showed the greatest impact on development. In summary, the results of the present work underline the hypothesis of a contribution of Pgps to IVM-resistance in nematodes. This becomes apparent in an increase of IVM-susceptibility in C. elegans strains either missing only a single Pgp or affected by the total loss of Pgpactivity, respectively, as well as in morphological and quantitative changes of the protein in dependence of the resistance level. In both cases, Pgp-11 was of particular importance, showing SNPs which are promising diagnostic candidates for detection of ML-resistance in P. equorum. To evaluate their suitability, further populations with known phenotypic resistance levels have to be investigated. This will be facilitated by the establishment of a pyrosequencing assay for two of the three SNPs. Furthermore, heterologous expression in a model organism of the susceptible and the presumably resistant genotype of Pgp-11 might enlighten their role. This might be conducted in C. elegans, since a pgp-11 loss-of-function strain for rescue experiments is already characterised more closely regarding its IVM susceptibility. For that reason, transgenic lines, containing PeqPgp-11 of the presumably resistant genotype and a control line were generated. First results of comparative analyses between these different lines produced encouraging results.