Etablierung des Nachweises direkter antibakterieller Wirkung humaner Defensine für die Untersuchung der Defensinproduktion im menschlichen Darm bei Morbus Crohn und Colitis ulcerosa

Abstract

Einleitung: Als Teil der angeborenen Immunität erhalten Defensine die intestinale Mukosabarriere aufrecht, die bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) beeinträchtigt ist. Ob eine direkte antibakterielle Wirkung von Defensinen aus dem Darmgewebe von Patienten mit CED im Vergleich zu nicht entzündetem Darm verändert ist, bleibt unklar. Bei unbekanntem Wirkmechanismus dieser Mediatoren ist ein experimenteller Vergleich nur mit Defensinen möglich. Methodik: Die antibakterielle Aktivität wurde durch die Änderung der optischen Dichte einer wachsenden Bakterienkultur erfasst und die Bedingungen mit Ampicillin als Standard optimiert. Zwei HBD2-Fusionsproteine wurden konzipiert. Über den Vektor pQE30 wurden sechs Histidinreste (HBD2-His) angefügt, so dass die Molekülgröße nicht geändert wurde. Die Fusion mit der Glutathion-S-Transferase (HBD2-GST) aus dem Vektor pGEX-2T diente der Vergrößerung des Moleküls und der affinitätschromatografischen Aufreinigung. Beide Fusionsproteine wurden unter Kontrolle des regulierbaren tac-Promoters in E. coli BL21 hergestellt. Humane Darmepithelien von CED-Patienten wurden nach Behandlung mit Acetonitril und Trifluoressigsäure sowohl im Assay auf ihre antibakterielle Aktivität als auch in einem HBD2-spezifischen Western- blot untersucht. Ergebnisse: Als Stamm mittlerer Empfindlichkeit wurde E.coli JM109 unter den folgenden standardisierten Kulturbedingungen verwendet: (i) Ansetzen der Vorkultur aus Einzelkolonien von Übernacht-Kulturen frischer Ausstriche, (ii) Vorkulturen ohne Antibiotika in Vollmedium bis zu einer OD600 von 0,25-0,35 und (iii) Hauptkulturen mit Antibiotika in 1:6 verdünntem Medium bis zu einer OD600 von 0,65-0,75 in der Kontrollkultur ohne Antibiotikum. Unter diesen Bedingungen betrug die halbmaximale inhibitorische Konzentration 3,9 μg/ml Ampicillin. Im densitometrischen Assay war das Bakterienwachstum in Gegenwart von HBD2-GST im Vergleich zu den Kontrollen GST und Glutathion reduziert. Das Entfernen des für die Bakterien nicht-toxischen Glutathion aus der HBD2-GST-Präparation führte zum Verlust der biologischen Aktivität. Aus den humanen Darmextrakten konnte keine auf Defensine zurückzuführende antibakterielle Aktivität nachgewiesen werden, da sich die verwendeten Lösungsmittel bereits als bakterizid erwiesen. Im spezifischen Western-blot war HBD2 in den extrahierten Darmproben nicht nachweisbar. Schlussfolgerung: Zusammenfassend wurden zwei HBD2-Fusionsproteine hergestellt, die sowohl als Standard für die bakterizide Aktivität von Defensinen, als auch im Western- blot verwendet werden können. In einer hier etablierten densitometrischen Methode mit E. coli JM109 wurde eine direkte antibakterielle Wirkung des HBD2-GST gezeigt, welches in ausreichenden Mengen hergestellt werden konnte. Seine biologische Aktivität war von der GST-Konformation abhängig. Der Verlust der biologischen Aktivität nach Entzug des Glutathion könnte auf Aggregationen zurückzuführen sein, die auch bei der durchgeführten denaturierenden Aufarbeitung der Darmproben wahrscheinlich waren. Die Nachweismethode für die antimikrobielle Aktivität war empfindlich für die Lösungsmittel, die bei der denaturierenden Proteinfällung für die Präparation von Defensinen aus humanen Darmepithelien verwendet werden. Mit Hilfe der im Rahmen dieser Arbeit hergestellten rekombinanten HBD2-Fusionsproteine können die Bedingungen für den direkten Nachweis der antimikrobiellen Peptide aus Geweben etabliert werden. Die Befunde aus dem antibakteriellen Nachweissystem sollten durch in- situ-Methoden, wie die Histologie, untermauert werden.

Introduction: As a part of the innate immunity, defensins support the preservation of the intestinal mucosal barrier which is affected in patients with inflammatory bowel disease (IBD). It is interesting whether a potential direct antibacterial activity of defensins in the bowel of IBD patients is changed compared to healthy persons. Since the mechanisms of defensin action are not fully understood, defensins themselves are the only reliable controls in respective studies. Methods: A densitometric method for the detection of direct antibacterial activity was established and ampicillin was used as a standard antibiotic for optimizing the conditions of the bacterial culture. Two HBD2 fusion proteins were constructed. The vector pQE30 added six histidine residues to obtain recombinant HBD2-His and this fusion did not change the molecular size of the defensin. The alternative partner Glutathion-S-Transferase (GST) was fused to HBD2 via the vector pGEX-2T. The enlarged HBD2-GST alleviated its purification by affinity chromatography. Both fusion proteins were expressed under the control of the regulated tac promotor in E. coli BL21. Intestinal specimens from IBD patients were treated with acetonitrile and trifluoroacetic acid and then analyzed with the densitometric bioassay and a HBD2-specific Western-blot. Results: Of the E. coli strains tested, E.coli JM109 showed a median sensibility and was chosen for the establishment of the optimum conditions of the densitometric assay that showed half maximum inhibition of bacterial growth by ampicillin at 3.9 μg/ml. Using this densitometric assay the purified recombinant HBD2-GST fusion protein was proved to reduce the bacterial growth in comparison to the controls GST and free glutathione. The removal of the non-bacteriotoxic glutathione from the HBD2-GST solution resulted in the loss of biological activity. The densitometric assay was not able to detect defensin-dependent antibacterial activity from the human intestinal specimens, due to the antibacterail effects of the solvents used in preparation. The specific Western-blot also failed to detect HBD2 from these intestinal specimens. Conclusion: Two recombinant HBD2 fusion proteins were produced and used as standards for the detection of defensins in Western-blot. HBD2-GST showed a significant antibacterial activity in the established densitometrc method using E. coli JM109 that was not affected by the GST fusion partner as long as glutathione and salts were present in the preparation. The loss of the biological activity after the removal of glutathione is possibly due to protein aggregation, which might also occur in defensins extracted from human intestinal specimens. Thus, solvent conditions substantially impact the direct antibacterial activities of defensins. The densitometric method was also proven to be sensitive for the solvents used during the denaturating protein purification from the intestinal specimens. The recombinant HBD2 fusion proteins and the antibacterial detection system established in this study, allow to test and define the conditions for the direct detection of the biological activity of human defensins. Other in-situ methods such as histology could corroborate the results from tissue samples.