Untersuchungen zum Hüllprotein und dem Tropismus des humanen endogenen Retrovirus K

Abstract

Humane Endogene Retroviren (HERVs) sind Sequenzen ehemals exogener Retroviren, die vor Millionen von Jahren Keimbahnzellen menschlicher Vorfahren infizierten und ein Bestandteil des Genoms wurden. Nach ihrer Integration entstanden bei allen heute bekannten Elementen inaktivierende Mutationen. Die am besten erhaltenen und exprimierten Proviren mit zum Teil noch vollständig offenen Leserahmen für alle viralen Proteine gehören zur Familie HERV-K(HML-2). Die postinsertionalen Mutationen verhindern oder erschweren generelle Aussagen zu funktionellen Eigenschaften dieser Proteine. Aus diesem Grund wurde für die Untersuchungen ein Hüllprotein des Elements HERV-K113 verwendet, dessen postinsertionale Mutationen identifiziert und revertiert wurden. Die Sequenz des so rekonstituierten Hüllproteins eines prototypischen HERV-K(HML-2) Provirus vom Zeitpunkt der Integration und die Sequenz des heutigen Hüllproteins wurden zudem codonoptimiert. Dadurch wurde die Expression um den Faktor 50 gesteigert. Dies ermöglichte die in dieser Arbeit erfolgte weitreichende Charakterisierung des Proteins. Das rekonstituierte Hüllprotein ist im Vergleich zu dem heutigen stark glykosyliert und wird in virale Partikel eingebaut. Es ist in der Lage Infektionen zu vermitteln. Sowohl die Glykosylierung des Hüllproteins als auch das C-terminale Ende sind kritisch für den Partikeleinbau und deren Infektiosität. Beides kann durch Deletion des nahezu kompletten zytoplasmatischen Endes signifikant gesteigert werden. Mit dem rekonstituierten funktionellen Hüllprotein und pseudotypisierten Viren wurde eine umfangreiche Tropismusstudie durchgeführt. Dabei wurde deutlich, dass HERV-K(HML-2) eine sehr breite Wirtsspezifität aufweist und Zellen der meisten Spezies infiziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verbreitung des noch unbekannten Rezeptors für HERV-K(HML-2) nicht gewebespezifisch ist, denn sowohl Leber-, Prostata-, Muskel-, Nieren-, Lungen-, Dickdarm-, Thymus-, Embryo-, Ovariums-, Bindegewebs-, Gehirn-, Harnblasen-, Keim- oder Hautzellen werden infiziert. HERV-K(HML-2) besitzt somit einen amphotropen Zelltropismus, wobei feline und canine Zelllinien besonders permissiv für Infektionen sind. Mit Hilfe von HERV-K113 Env-IgG- Immunoadhäsinen wurde der Tropismus für einige der Zellen bestätigt. In ersten Rezeptorstudien konnte gezeigt werden, dass der Transferrin Rezeptor 1 und die Hyaluronidase 2, die spezifischen Rezeptormoleküle der nahe verwandten Betaretroviren Mouse Mammary Tumor Virus und Jaagsiekte Sheep Retrovirus, den Eintritt von HERV-K113 in die Wirtzelle nicht vermitteln.

Human endogenous retroviruses (HERVs) are sequences of ancient exogenous retroviruses that millions of years ago infected the germ cell line of human ancestors, becoming thereby part of the genome. Subsequent to integration, all HERVs known today suffered inactivating mutations. The best preserved and expressed proviruses, some of which have maintained open reading frames for all viral proteins, belong to the HERV-K(HML-2) family. However, postinsertional mutations make it difficult to draw general conclusions concerning the functional characteristics of these proteins and for this reason we used in these studies a HERV-K113 envelope protein (Env) for which postinsertional mutations had been identified and reversed. Furthermore this sequence, representing the reconstituted prototypical HERV-K(HML-2) provirus existing at the time of integration, together with the sequence of the present-day Env, was codon optimized. This resulted in a 50-fold or more increase in expression, allowing the protein to be characterized in detail. Compared to the modern envelope protein, the reconstituted ancient Env is heavily glycosylated, moderately incorporated into retroviral particles and able to mediate entry. The carbohydrates of the envelope protein as well as the cytoplasmic tail are critical for particle incorporation and infectivity, functions that can both be dramatically enhanced by deletion of virtually the complete cytoplasmic tail. Protein tropism was extensively studied using the reconstituted functional Env and pseudotyped viral particles. HERV-K(HML-2) was shown to have a broad host range and to be able to infect cell lines of most species studied. The results suggest that the distribution of the still unknown receptor is not tissue specific as many tissues including liver, prostate, muscle, kidney, lung, colon, thymus, embryo, ovary, fibroblast, brain, urinary bladder, germ cell and skin are permissive to HERV-K(HML-2) infection. HERV-K(HML-2) therefore has an amphotropic cell tropism, with feline and canine cell lines being particularly susceptible. The tropism of some of these cell lines was confirmed using HERV-K113 Env immunoadhesins. Initial receptor studies demonstrated that Transferrin Receptor 1 and Hyaluronidase 2, the specific receptor proteins used by the closely related βretroviruses, Mouse Mammary Tumor Virus and Jaagsiekte Sheep Retrovirus, do not facilitate the entry of HERV-K113 into host cells.