Untersuchung der Auswirkungen simulierter Schwerelosigkeit auf Schilddrüsenzellen

Abstract

Ziel der vorliegenden Dissertation war die grundlegende Charakterisierung der Effekte, die durch simulierte Schwerelosigkeit bei gutartigen und malignen Schilddrüsen-Zellen hervorgerufen werden können. Es wurden drei Zelllinien für die Versuche verwendet: Die follikuläre Schilddrüsen-karzinomzelllinie ML-1, die papilläre Schilddrüsenkarzinomzelllinie ONCO-DG1 und die gutartige Schilddrüsenzelllinie HTU-5. Zur Simulation der Mikrogravitation wurde ein dreidimensionaler Klinostat ( Random Positioning Machine ) verwendet. Die Zellen wurden bis zu 5 Tage bei Bedingungen von 1 g und simulierten 0 g kultiviert. Es wurden Auswirkungen auf die Morphologie, das Zytoskelett, die Extrazelluläre Matrix und den programmierten Zelltod untersucht. Hierzu wurden verschiedene Methoden verwendet: Phasenkontrast-, Fluoreszenz-, Konfokale Laserscan- und Transmissionselektronen-mikroskopie, Immunzytochemie, DAPI-, TUNEL- und Vitalfärbungen, sowie Durchfluss-zytometrie und Westernblotanalyse. Bereits nach 12 Stunden kam es zur Bildung dreidimensionaler MCTS. Nach 24 h und 48 h Klinorotation fand sich im Vergleich zu Inkubator- und Bodenkontrollen eine vermehrte Produktion von Vimentin und Vinculin sowie ein deutlicher Anstieg extrazellulärer Matrix-proteine wie Laminin, Fibronektin, Kollagen Typ I und III, Osteopontin und Chondroitinsulfat. Darüber hinaus ließ sich programmierter Zelltod nachweisen. Es zeigte sich eine vermehrte Expression von aktivierter Caspase 3, Fas, p53, PARP und Bax-Proteinen sowie eine Reduktion von Bcl-2. Es fanden sich weitere Beweise für Apoptose durch den Nachweis von DNA-Laddering sowie DAPI- und TUNEL-positiven Schilddrüsenzellen. Bereits nach 30 min konnten deutliche Veränderungen am Zytoskelett im Bereich der Mikrotubuli (Tubulin) und Intermediärfilamente (Vimentin, Cytokeratin) nachgewiesen werden. Nach 48 h zeigte das Zytoskelett eine Reorganisierung. Zusammenfassend untersuchte diese Arbeit erstmalig die Wirkung simulierter Schwere-losigkeit auf Thyreozyten. Sowohl ML-1 und ONCO- DG1 als auch HTU-5 Zellen bildeten Sphäroide. Es kam zur Induktion von Apoptose, Veränderungen der Extrazellulären Matrix und des Zytoskeletts. Dem Klinostaten kommt hiermit eine wichtige Bedeutung zu. Er könnte im Bereich Tissue Engineerings zur Herstellung und Kultivierung von Sphäroiden verwendet werden. Multizelluläre Sphäroide sind besonders im Bereich der Onkologie von großem Interesse, da sie in vivo Tumoren eher entsprechen als Monolayerkulturen. Darüber hinaus können Tierversuche eingespart werden. Weiterhin bietet er als so genannte ground based facitlity vielen Forschern die Möglichkeit, im Bereich der Weltraummedizin grundlegende Experimente durchzuführen.

The aim of the present study was to characterize the effects of simulated weightlessness on benign and malignant thyrocytes. Three cell lines were used for the experiments: The follicular thyroid carcinoma cell line ML-1, the oxyphilic papillary thyroid carcinoma cell line ONCO-DG1 and the thyroid cell line HTU-5, derived from normal thyroid tissue. In this study, microgravity was simulated by a three-dimensional clinostat ( Random Positioning Machine ). The cells were cultured up to five days under conditions of 1 g and simulated 0 g. The study focus lies on the effects on morphology, the cytoskeleton, extracellular matrix proteins, and mechanisms of apoptosis. We used phase contrast, fluorescence, confocal laser scanning and transmission electron microscopy, immunocytochemistry, DAPI-staining, TUNEL-staining, viability staining, as well as flow cytometry and western blot analysis including densitometry. Formation of three-dimensional spheroids occurred within 12 h. Vimentin and vinculin as well as ECM proteins such as laminin, fibronectin, collagen type I and III, osteopontin, chondroitin sulphate were clearly enhanced after 24 h and 48 h of simulated microgravity compared to incubator or ground control cells. Moreover, simulated microgravity induced apoptosis of thyrocytes. Throughout there was an increase in apoptotic cells among populations cultured under 0 g compared to control cells grown in an 1 g environment. Here, we demonstrate an increase in activated caspase 3, Fas, Bax, p53 and PARP and a decrease in bcl-2 for carcinoma cells. Other methods such as DNA-laddering, TUNEL staining, DAPI-staining proved apoptosis in all cell lines. As early as 30 min, we could detect changes of the cytoskeleton concerning alterations of microtubules (tubulin) and intermediate filaments (vimentin, cytokeratin). Within 48 h the cytoskeleton was reorganized again. In summary, for the first time this study showed the effects of simulated microgravity on human thyrocytes. ML-1, ONCO-DG 1 and HTU-5 cells formed multicellular spheroids. Moreover, simulated 0 g induced apoptosis, changed the cytoskeleton and increased the amount of extracellular matrix proteins. The three-dimensional clinostat represents an important tool for the formation of MCTS which can be used in tissue engineering for their production and culture. Multicellular spheroids are of great interest in oncology because they are very similar to in vivo tumors. In addition, this method helps to spare animal experiments. Furthermore, the clinostat as ground based facility offers a new possibility to perform experiments in the field of modern space medicine.