Identifizierung und Charakterisierung von ERG-regulierten Signalwegen bei akuten Leukämien

Abstract

Das ETS-related Gene ERG gehört zur Familie der ETS Transkriptionsfaktoren (TF) und übt Funktionen in der frühen zellulären Entwicklung aus und ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer normalen Hämatopoese [49-51, 56]. Darüber hinaus kommen Fusionsgene zwischen ERG und verschiedenen Funktionspartnern bei malignen Erkrankungen wie der akuten myeloischen Leukämie (AML), dem Ewing Sarkom und Prostatakarzinomen vor [67, 76, 82]. Des Weiteren konnte eine hohe ERG-Expression als ungünstiger prognostischer Faktor in der AML und der akuten T-lymphoblastischen Leukämie (T-ALL) identifiziert werden [71, 72]. Trotz großer Fortschritte in den Therapieoptionen in den letzten Jahren gibt es immer noch Patienten mit AML oder T-ALL, deren Prognose auf Grund eines schlechten Therapieansprechens und hoher Rezidivraten schlecht ist. Eine solche Gruppe von Patienten sind jene mit hoher ERG-Expression, für die ein möglicher Therapieansatz die Inhibition ERG-regulierter Signalwege sein könnte. Allerdings sind bisher nur einige wenige Gene, deren Transkription durch ERG reguliert wird (Targetgene), bekannt, so dass das Ziel dieser Arbeit war, Targetgene des TFs ERG zu identifizieren, um somit mögliche Ansätze für neue Therapieoptionen der akuten Leukämien zu entwickeln. Daher wurden Chromatin-Immunopräzipitation on chip (ChIP-chip) Versuche an leukämischen Zelllinien (Jurkat und HL60) und primären Leukämieproben (5 AML, 1 T-ALL) durchgeführt. Nach statistischer Auswertung wurden die generierten Genlisten einer bioinformatischen Analyse unterzogen. Dabei zeigte sich eine signifikante Anreicherung des WNT/β-Catenin Signalwegs in der Zelllinie Jurkat sowie AML D und T-ALL (p<0,05). Des Weiteren konnte eine Anreicherung von Signalwegen wie PI3K/AKT, HMGB1, TNFR1, CNTF, p53 und Interferon Signalwege gezeigt werden. Ferner waren Prozesse der Zellmigration und –adhäsion sowie der zellulären Entwicklung und Regulation, Zellwachstum und Proliferation und Prozesse multizellulärer Organismen angereichert (p<0,05). Da diese Prozesse im Rahmen der Leukämogenese Veränderungen unterliegen, ist es denkbar, dass ERG durch die Beeinflussung dieser biologischen Funktionen ursächlich an der Leukämogenese beteiligt ist. Zur Validierung von Targetgenen im Jurkat ChIP- chip mittels quantitativer real-time Polymerasekettenreaktion (qrt-PCR) wurden 23 Gene mit Funktionen in der Hämatopoese, Onkogenese und WNT/β-Catenin Signalweg ausgewählt. Für 17 dieser Gene konnte eine Anreicherung bestätigt werden. Zur Validierung mittels qrt-PCR in den primären Leukämieproben wurden 5, in der Literatur beschriebene, mit ERG koregulierte Gene ausgewählt. Von diesen konnten WNT11 und DAAM1 in 5 bzw. allen 6 Proben durch eine mindestens 2-fache Anreicherung gegenüber der IgG-Kontrolle bestätigt werden. Die übrigen Gene zeigten lediglich eine Anreicherung in einer der Proben. Die Expression der validierten Gene wurde mittels ERG knock down und Überexpression untersucht. Dabei zeigte sich eine konstante und signifikante Verminderung der Expression des Gens WNT11 mit der Reduktion der ERG-Expression durch knock down und eine Induktion der WNT11-Expression durch ERG-Induktion. Dies spricht dafür, dass ERG als Transkriptionsaktivator von WNT11 fungiert. Weiterhin wurde die Proliferation ERG exprimierender Zellen mittels WST-Test bestimmt. Dabei zeigt sich ein Proliferationsvorteil der Zellen mit ERG-Induktion gegenüber Zellen ohne ERG-Expression bei der Behandlung mit dem Inhibitor der Glykogen-Synthase-Kinase 3β, BIO und dem Multikinaseinhibitor Sorafenib. Dies lässt vermuten, dass sich Zellen mit hoher ERG-Expression dem antiproliferativen Effekt dieser Substanzen entziehen, indem sie zur vermehrten Expression von Gegenspielern, wie z.B. WNT11, beitragen. Daraus ergibt sich, dass die Substanzen BIO und Sorafenib keine geeignete Therapieoption für akute Leukämien mit hoher ERG-Expression darstellen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass ERG die Expression intrazellulärer Signalkaskaden wie WNT/β-Catenin, PI3K/AKT, HMGB1, TNFR1, CNTF, p53 und Interferon Signalwege reguliert und das Beispiel der Resistenz ERG exprimierender Zellen gegenüber BIO und Sorafenib verdeutlicht die Notwendigkeit der weiteren Exploration dieser Vorgänge, um gezieltere Therapien zu entwickeln.

The ETS related gene ERG is a member of the ETS family of transcription factors (TF) and is associated with fundamental functions in cellular development. Furthermore, ERG has been implicated to be essential for the maintenance of a normal hematopoietic stem cell pool. Translocations involving the ERG locus result in fusion genes that can be found in acute myeloid leukemia (AML), Ewing sarcoma and prostate cancer. High ERG mRNA expression is an independent negative prognostic factor in AML and acute t-lymphoblastic leukemia (T-ALL). Despite great advances in the treatment of AML and T-ALL, there is still a great amount of patients with poor prognosis due to failure of first line therapy and early relapse. Hence, patients with high ERG expression might possibly profit from a therapeutic strategy aiming at the inhibition of ERG-regulated signaling pathways or ERG target genes. However, so far there are only very few ERG-regulated target genes identified. Thus, the main goal of this work was to identify ERG-regulated target genes as potential therapeutic targets in acute leukemia. Herein, chromatin- immunoprecipitation-on-chip (ChIP-chip) was applied on 8 samples (T-ALL cell line Jurkat, HL60 cell line as negative control and 6 primary leukemia samples – 5 AML, 1 T-ALL). Following statistical analysis, the enriched gene lists were analyzed using bioinformatics. Bioinformatic analysis revealed an enrichment of WNT/β-catenin, PI3K/AKT, TNFR1, interleukin, and p53 signaling pathways. Furthermore, fundamental biological functions enriched among ERG target genes included cellular migration and adhesion, cellular development, and proliferation. Potentially, these functions are influenced by ERG and altered in their activity during ERG-mediated leukemogenesis. In order to validate target genes, 23 genes with functions in hematopoiesis, oncogenesis, and WNT/β-catenin signaling were chosen for validation by quantitative real- time polymerase chain reaction (qrt-PCR). Seventeen were validated. The expression of these genes was investigated under the influence of the ERG expression. Thereby, the expression of WNT11 could be reduced by ERG knock down and induced by ERG overexpression. Thus, ERG seems to be a transcriptional activator of WNT11. Proliferation of ERG expressing cells has been measured by WST assay. ERG expressing cells show a proliferative advantage over cells without ERG expression when treated with the protein kinases BIO and sorafenib, suggesting an ERG-mediated resistance to the treatment with these substances. It is likely, that cells with high ERG expression escape the anti-proliferative effect of BIO and sorafenib by an ERG-mediated intrinsic resistance due to the synthesis of antagonizing proteins, like WNT11. In conclusion, this work shows, that ERG regulates the expression of genes associated with intracellular signaling cascades like WNT/β-catenin, PI3K/AKT, TNFR1, interleukin, and p53. The example of the ERG- mediated resistance to the treatment with BIO and sorafenib enhances the necessity of further exploration of these correlations in order to optimize therapeutic strategies.