Auswirkungen von tiefer Hypothermie und Wiedererwärmung auf die morphologischen und funktionellen Eigenschaften von humanen Endothelzellen

Abstract

Zum Schutz unreifer Organsysteme während kardiochirurgischer Eingriffe unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine bei Neugeborenen und Säuglingen werden die Patienten auf eine minimale Körpertemperatur von 17°C heruntergekühlt. Jedoch sind prolongierte Inflammation und das „Kapillar-Leck-Syndrom“ häufige Komplikationen nach Korrekturoperationen bei Neugeborenen und Säuglingen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von tiefer Hypothermie und Wiedererwärmung auf humane Endothelzellen sowie deren medikamentöse Beeinflussung zu untersuchen. Dazu wurden stimulierte und unstimulierte humane umbilikal venöse Endothelzellen (HUVEC) nach einem speziellen Zeit-Temperatur-Protokoll, in Analogie zu den klinischen Bedingungen, gekühlt und anschließend wiedererwärmt. Zusätzlich wurde ein Teil der Zellen vor Versuchsbeginn mit Methylprednisolon (MP) und/oder Tacrolimus (TAC) sowie mit spezifischen MAPK- Inhibitoren (U0126, SB203580 und SP600125) vorbehandelt. Es wurden die morphologischen Veränderungen und die Zellvitalität analysiert. Außerdem wurde die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6 und der Chemokine IL-8 und MCP-1 sowie die Aktivierung der MAPKs ERK 1/2, SAPK/JNK, p38 untersucht. Tiefe Hypothermie führte im Zellverband unstimulierter Endothelzellen zur Ausbildung interzellulärer Lücken, die sich jedoch während der Wiedererwärmung zurückbildeten. Nur die kombinierte Gabe von MP und TAC verhinderte diese Hypothermie-bedingten morphologischen Veränderungen vollständig. Mit TNF-α stimulierte HUVEC wiesen zwei Stunden nach Wiedererwärmung eine signifikant höhere IL-6 Sekretion auf. Diese inflammatorische Antwort konnte durch kombinierte Applikation von MP und TAC unterdrückt werden. Am Effektivsten wurde die vermehrte IL-6 Sekretion durch die spezifische Blockade der p38 Kinase mittels des selektiven Inhibitors SB203580 gesenkt. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die kombinierte Gabe von MP und TAC sowie die spezifische Blockade von p38 in vitro potentiell neue Therapiemöglichkeiten zur Vermeidung von Endothelzell-Dysfunktionen und zur Reduktion einer gesteigerten Inflammation nach Hypothermie und Wiedererwärmung darstellen.

To protect immature organ systems during corrective cardiac surgery, patients are cooled to a minimal body temperature of 17°C. However, prolonged inflammation and “capillary leakage” are common unwanted effects after corrective cardiac surgery in newborns and infants. The aim of this study was to investigate the effect of deep hypothermia and rewarming on human endothelial cells, as well as the treatment with Methylprednisolone and/or Tacrolimus. Stimulated and unstimulated human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were exposed to a dynamic temperature protocol analogous to clinical settings. Furthermore, endothelial cells were pretreated with Methylprednisolone and/or Tacrolimus as well as with Mitogen-Activated Protein Kinase-inhibitors (U0126, SB203580 and SP600125). Morphological changes, cell viability, expression of the pro-inflammatory cytokine IL-6 and the chemokines IL-8 and MCP-1 and ERK 1/2, SAPK/JNK and p38 activation were investigated. Hypothermia led to intercellular gap formation and elongated cell shapes in unstimulated endothelial cells. Upon rewarming, endothelial cell integrity was restored. Only the combined treatment with MP and TAC inhibited these hypothermia-induced changes. Stimulated endothelial cells secreted significantly higher IL-6 protein two hours after rewarming. The combined pretreatment with MP and TAC served to inhibit the increased IL-6 secretion. SB203580 as specific p38 inhibitor most effectively down regulated the unwanted IL-6 release after cooling and rewarming. These results suggest that the combined treatment of MP and TAC, as well as the inhibition of p38 or components of the p38 pathway could be a promising and selective therapeutic target to prevent endothelial dysfunction and prolonged inflammation after deep hypothermia and rewarming.