Vergleich verschiedener Kulturbedingungen für die Differenzierung leukämischer Blasten zu dendritischen Zellen

Abstract

Dendritische Zellen (DC) können als fähigste antigenpräsentierende Zellen des Immunsystems für eine Immuntherapie gegen onkologische Erkrankungen wie die Leukämien dienen. Sie lassen sich in vitro direkt aus leukämischen Blasten differenzieren und bieten damit die Möglichkeit, dem Immunsystem alle tumorassoziierten Antigene präsentieren zu können. Trotz der Vielzahl veröffentlichter Generierungsprotokolle bleiben Fragen zur optimalen Präparation der Zellen sowie der Applikationsart im Rahmen einer klinischen Studie unbeantwortet. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Verwendung von Humanserum und der Zusatz von fetalem Kälberserum äquivalent sind für die Differenzierung von DC aus leukämischen Blasten. Da tierische Seren die Risiken allergischer Reaktionen sowie der Übertragung von Infektionen wie der bovinen spongiformen Enzephalopathie bergen, ist die Verwendung rein humaner Komponenten für den klinischen Einsatz der differenzierten Zellen von Bedeutung. Des Weiteren erwies sich das aus rein humanen Komponenten bestehende Medium QBSF 60 als dem Standardmedium RPMI 1640 gleichwertig für die Differenzierung leukämischer Blasten zu DC. Anders als QBSF 60 ist RPMI 1640 nicht für die klinische Anwendung zugelassen, womit eine weitere Hürde für den klinischen Einsatz der DC genommen wurde. Sowohl aus den Blasten der 16 verschiedenen AML- als auch der 21 verschiedenen ALL- Patienten konnten morphologisch reife und vitale DC differenziert werden, die die typischen zytoplasmatischen Zellfortsätze tragen. Es zeigte sich in allen getesteten Kulturkonditionen eine signifikante Expressionssteigerung der für reife DC typischen Oberflächenmoleküle CD83 und HLA-DR. In der gemischten Lymphozytenkultur konnte ihre Fähigkeit, allogene T-Lymphozyten zu aktivieren nachgewiesen werden. Die Zugabe von IL-3 und IL-4 zu der Zytokinkombination bestehend aus TNFα, GM-CSF, SCF und Flt-3L erbrachte keine Vorteile für die Differenzierung der AML-Blasten zu DC. Aus diesem Grund kann auf beide Interleukine verzichtet werden. Aufgrund der erhöhten Ausbeute reifer DC erwies sich für die Differenzierung der ALL-Blasten die Zytokinkombination bestehend aus TNFα, GM-CSF, SCF, Flt-3L, IL-4 und CD40L als überlegen im Vergleich mit der gleichen Kombination ohne die Zugabe von IL-4 und CD40L. Sowohl für die AML- als auch die ALL-Kulturen empfiehlt sich für eine höchstmögliche Reinheit der DC eine Differenzierungszeit von einer Woche. In diesem Zeitraum konnten die höchsten Prozentzahlen reifer DC gemessen werden. Die höchsten Zellzahlen reifer DC hingegen wurden nach einer Kultivierungszeit von zwei Wochen erreicht. Im Transmigrations-Assay konnte nur eine gering ausgeprägte Migrationsfähigkeit der gezüchteten DC entlang der getesteten Chemokine nachgewiesen werden. Die Wanderung der DC zu den anliegenden Lymphknoten stellt aber eine wichtige Voraussetzung für die Einleitung der Immunantwort dar, da hier die Interaktion mit den T-Lymphozyten stattfindet. Aus diesem Grund sollten die differenzierten DC im Rahmen einer klinischen Studie direkt in die Lymphknoten injiziert werden.

Dendritic cells (DC) are the most potent antigen-presenting cells with a key role in the activation of the immune system. They are an interesting target for a vaccine based immunotherapy for the treatment of malignant diseases like leukemia. DC can be generated by cultering leukemic blasts with certain cytokines, and they maintain the expression of the leukemia-associated antigens. Despite of the variety of published culture protocols, so far no standard has been established. Here we provide evidence that the use of human serum is as potent as fetal bovine serum for the generation of leukemic DC from ALL and AML-blasts. This is important because the use of fetal bovine serum introduces the risk of xenosensibilization, as well as the possible transfer of bovine diseases such as bovine spongiform encephalopathy. The culture media QBSF 60 and RMPI 1640 were equivalent. The coexpression of CD83 and HLA-DR was used to identify mature DC. For the AML-blasts, the cytokines TNFα, GM-CSF, SCF and Flt-3L were adequate for the differentiation. For the ALL-blasts, the addition of IL-4 and CD40L to those above achieved a higher yield of DC. The generated DC showed a mature morphology and phenotype and were able to stimulate allogeneic t-cells. The transmigration capacities were low, so the leukemic DC should be injected into the lymph nodes.