dc.contributor.author
Goischke, Alexandra
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:23:47Z
dc.date.available
2009-06-09T11:34:58.966Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10436
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14634
dc.description.abstract
Die α-Protocadherine gehören zu der Familie der geclusterten Protocadherine,
die sich aufgrund auffälliger Strukturmerkmale klar von anderen Cadherin-
Familien abgrenzen. Im Gegensatz zu klassischen Cadherinen besitzen sie sechs
anstelle von fünf Cadherin-Homologiedomänen, eine transmembranäre Domäne und
einen zytoplasmatischen Bereich, der keine Homologien zu dem anderer Cadherine
aufweist. Die ungewöhnliche Anordnung der α-, β- und γ-Protocadherine in Form
von Genclustern erinnert an die genomische Organisation der Immunglobuline
bzw. T-Zell-Rezeptoren. Es wird davon ausgegangen, dass sich durch alternative
Promotorwahl im Falle des α-Clusters 14 verschiedene primäre Transkripte aus
den hintereinander aufgereihten „variablen“ Exons ergeben, die durch cis-
Spleißen mit den drei am Ende des Clusters gelegenen „konstante“ Exons
verbunden werden (Kemler, 2001). Diese Anordnung sowie die große Vielfalt der
geclusterten Pcdh mit weit über 50 Mitglieder und ihre Expression im zentralen
Nervensystem lassen eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Gehirns und
der Ausbildung neuronaler Verschaltungen vermuten. Die geclusterten Pcdh sind
jedoch funktionell noch unzureichend charakterisiert; bisherige Studien
führten teilweise zu widersprüchlichen Ergebnissen. Um genauere Erkenntnisse
über die Funktionsweise der Protocadherine zu gewinnen, ist die
Identifizierung ihrer zellulären Interaktionspartner enorm wichtig. In dieser
Arbeit wurde die intrazelluläre Domäne der α-Protocadherine im Hinblick auf
ihre mögliche Interaktion mit zytoplasmatischen Proteinen untersucht, um
daraus Hinweise auf die Beteiligung der α-Protocadherine an der Regulierung
zellulärer Funktionen ableiten zu können. Besonders im Hinblick auf die
Embryogenese sind konservierte Signaltransduktionswege und die Prozesse der
Zelladhäsion von fundamentaler Bedeutung. Zur Realisierung dieses Vorhabens
wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System angewendet. Es wurden zunächst die cDNAs
mehrerer α-Protocadherine der Maus kloniert. Die zytoplasmatische Domäne eines
spezifischen Protocadherins, Pcdh α7, wurde im nächsten Schritt dafür
eingesetzt, drei Hefe-Zwei-Hybrid-Bait-Vektoren herzustellen, die den
variablen Bereich, den konstanten Bereich oder die gesamte zytoplasmatische
Domäne beinhalten. Aus der cDNA des Gehirns einer knapp 2 Wochen alten Maus
wurde eine cDNA-Bank in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Prey-Vektor hergestellt und
diese nach Durchführung der erforderlichen Kontrollen zur Suche nach
Interaktionspartnern des murinen α7-Protocadherin eingesetzt. Aus 1,6 x 10^6
Klonen wurden initial durch eine erste Selektion (HIS3+, ADE2+) insgesamt 283
Klone identifiziert, die mit der gesamten zytoplasmatischen Domäne des Pcdh α7
interagieren (CPvc-Screen), und 162 Klone aus 1,4 x 10^6, die speziell mit dem
variablen Bereich der zytoplasmatischen Domäne interagieren (CPv-Screen). Die
möglichen Interaktionspartner wurden durch die Untersuchung der Aktivierung
eines weiteren Reportergenes (MEL1) auf 20 Klone des CPvc-Screen und 11 Klone
des CPv-Screen eingeschränkt. Diese Klone wurden sequenziert, mit bekannten
mRNA-Sequenzen der Maus verglichen und einem Rescreen unterzogen. Letztlich
bestätigten sich vier positive Klone des CPvc-Screen, die jedoch alle
Abschnitte der gleichen, bislang unbekannten cDNA enthielten. Das in dieser
Arbeit gefundene hypothetische Protein wird derzeit in Anschlussarbeiten
weiter charakterisiert, wobei verschiedene Methoden (Co-Lokalisation in der
Immunfluoreszenzmikroskopie, Co-Immunpräzipitation, Bindungsassays, etc.) zur
Anwendung kommen werden. Ebenfalls weiter gearbeitet werden kann mit der in
dieser Arbeit vollständig klonierten Protocadherinen α1, α4, α7, α8 und α12.
de
dc.description.abstract
The α-Protocadherins, the members of the clustered protocadherins, exhibit
distinct structural features which make them unique within the cadherin
superfamily. In contrast to classical cadherins, they have six instead of five
extracellular cadherin repeats and a cytoplasmic domain which no homolgie to
the cytoplasmic domain of other cadherins. The clustered Protocadherins are
arranged in three neighboring gene clusters. The most striking feature of
these clusters is a highly specific arrangement of variable and constant
regions resembling distantly to the immunoglobulin and T-cell gene clusters.
However, genomic recombination has been ruled out and it appears that every
neuron expresses just one variable region that is spliced – in case of α- and
γ-Pcdh – to the constant region made from three exons. Due to this
organization and to their highly specific expression in the central nervous
system, protocadherins are believed to play an important role in CNS
differentiation and neural circuitry programming. They are thought to perform
their function by recognizing appropiate partners on opposing surfaces and
transmitting this information either through a cytoskeletal link or through a
signal transduction cascade. However, still little is known about their
cellular function and their cytoplasmic binding partners. In this thesis the
cytoplasmic domain of α-Protocadherins has been chosen to find potential
intracellular binding partners by using the Yeast-Two-Hybrid-System. A number
of murine Pcdh α cDNAs were cloned and Pcdh α7 was chosen to construct three
different Yeast Two-Hybrid bait vectors encompassing either the variable part
of the cytoplasmic domain (CPv), or the constant domain (CPc), or both (CPvc).
Whole brain mRNA of a 2 week old mouse was used to build a prey library.
Whereas the CPc bait was interacting with all prey constructs, including the
empty vector, without being truly autoactivating, the other CPv and CPvc baits
yielded in the initial screen 162 (out of 1.4 x 10^6 sucessfully mated cells)
and 283 (out of 1.6 x 10^6 sucessfully mated cells) interacting clones,
respectively (HIS3+, ADE2+). All 162 positive clones of the initial CPv and
283 of the CPvc screen were analyzed individually for the expression of the
third selection marker Mel1, encoding α-galactosidase. Under this more
stringent selection only 11 clones stained positive of the CPv and 20 of the
CPvc screen. From those 31 yeast clones, the cDNA inserts were bidirectionally
sequenced and submitted to a BLAST analysis. Four sequences referred to known
proteins but were in the wrong reading frame or reverse orientation, eight
sequences corresponded to typical false positive matches, like ribosomal
proteins, seven exhibited no similarity to any listed transcript and 12
yielded matches to a total of 6 different promising candidate proteins that
are further analysed.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Etablierung eines Hefe-Zwei-Hybrid-Systems zur Suche nach zytoplasmatischen
Interaktionspartnern der α-Protocadherine
dc.contributor.contact
alex_goischke@hotmail.com
dc.contributor.firstReferee
Priv.-Doz. Dr. R. Geßner
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. K. Sperling, Prof. Dr. med. Th. Arendt
dc.date.accepted
2009-06-14
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000009531-2
dc.title.translated
Yeast Two-Hybrid screening for cytoplasmic interaction partners of
α-protocadherins
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000009531
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000005432
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access