Die Rolle der kommensalen Darmflora und der Rezeptoren des angeborenen Immunsystems bei der Campylobacter jejuni-Enteritis im Mausmodell

Abstract

C. jejuni stellt weltweit einen der häufigsten Verursacher bakteriell bedingter akuter Gastroenteritiden beim Menschen dar. In Deutschland ist C. jejuni seit 2007 der häufigste Erreger gemeldeter bakterieller Durchfallerkrankungen. Das Fehlen geeigneter Säugetiermodelle, welche einen Entzündungszustand nachahmen wie er beim Menschen beobachtet wird, hat bislang das Verständnis der Pathogenese der C. jejuni-Enteritis erschwert. Konventionell besiedelte Mäuse weisen eine ausgeprägte Kolonisationsresistenz gegenüber C. jejuni auf. Um die Rolle der kommensalen Darmflora hinsichtlich der Kolonisationsresistenz zu untersuchen haben wir neue murine Infektionsmodelle entwickelt. Durch die Verwendung gnotobiotischer Mäuse konnte der kausale Zusammenhang zwischen der murinen Darmflora und der Kolonisationsresistenz gegenüber C. jejuni bestätigt werden. C. jejuni besiedelte den gesamten Gastrointestinaltrakt mit humaner nicht jedoch mit muriner Flora assoziierter gnotobiotischer Wildtypmäuse. Das stabile Ansiedeln von C. jejuni im gnotobiotischen und mit humaner Flora assoziierten Modell war mit einem signifikanten Anstieg apoptotischer Zellen, T-Zellen, regulatorischer T-Zellen, neutrophiler Granulozyten und B-Zellen im Colon in situ verbunden. Analysen der mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine im Colon gnotobiotischer Mäuse zeigten nach Infektion mit C. jejuni einen Anstieg von TNF-α, IFN-ɤ, IL-18 und IL-23p19. Das Überkommen der Kolonisationsresistenz konnte ebenso in einem akuten bzw. chronischen Inflammationsmodell beobachtet werden. Dem Modell der mit humaner Flora assoziierten Maus sowie den akuten bzw. chronischen Inflammationsmodellen war die höhere Last an Enterobacteriaceae gemeinsam. Wir konnten zeigen, dass die sekundäre, dauerhafte Erhöhung der intraluminalen E. coli-Dichte zu stabilen C. jejuni B2-Lasten im Faeces der Tiere führte. Um eine altersabhängige Entwicklung der Kolonisationsresistenz zu untersuchen, wurden 3 Wochen alte C57BL/10-Wildtypmäuse mit C. jejuni infiziert. Über einen Untersuchungszeitraum von ca. 3 Monaten konnten ein stabiles Ansiedeln des Pathogens sowie positive Haemoccult-Teste nachgewiesen werden. Mit der Infektion gnotobiotischer C10/IL10-/--Tiere, bei welchen die Eradikation der Darmflora direkt nach Absetzten von der Mutter im Alter von 3 Wochen begonnen wurde, konnten wir ein durch C. jejuni induzierbares akutes Inflammationsmodell etablieren, welches der beim Menschen beobachteten Schwere der Entzündung nahekommt. C. jejuni- nicht aber E. coli-infizierte Tiere entwickelten eine schwere ulzerative Colitis und blutige Durchfälle. Die starke Inflammation des Colons ging mit einem signifikanten Anstieg apoptotischer Zellen, neutrophiler Granulozyten, T-Zellen, regulatorischer T-Zellen und B-Zellen im Colon in situ einher. Zytokinmessungen aus Colon- Organkulturüberständen ergaben einen signifikanten Anstieg von TNF-α, IFN-ɤ, IL-12p70, IL-22 und MCP-1. Analysen der mRNA-Expression im Colon konnten den auf Proteinebene beobachteten Anstieg von TNF-α, IFN-ɤ und IL-22 bestätigen und zeigten weiterhin signifikant höhere Expressionen von IL-6 und IL 23 im Vergleich zu E. coli-infizierten Tieren. Die Untersuchung der Rolle von TLR4 in diesem Modell akuter Inflammation gab Hinweise auf eine milder verlaufende Entzündung nach C. jejuni-Infektion bei TLR4-/-/IL10-/--Tieren im Vergleich zu C10/IL10-/--Tieren. Dieser Befund fand Bestätigung in der gegenüber C10/IL10-/--Mäusen signifikant geringeren Anzahl apoptotischer Zellen, T-Zellen und regulatorischer T-Zellen im Colon sowie signifikant niedrigeren TNF-α-, IFN-ɤ- und IL-6-Konzentrationen auf Proteinebene und einer ebenfalls signifikant geringeren mRNA-Expression von IL-22 und IL-23 im Colon bei C. jejuni-infizierten TLR4-/-/IL10-/--Mäusen. Die Befunde bestätigen die Rolle von TLR4-Signalwegen bei C. jejuni-Infektionen im Mausmodell. Diese Ergebnisse erlauben wertvolle Einblicke in die Immunantwort bei der C. jejuni-Enteritis und ermöglichen zukünftig deren weitere Charakterisierung.

Campylobacter jejuni is among the leading bacterial agents causing enterocolitis worldwide. The understanding of immunopathology underlying human campylobacteriosis is hampered by the lack of appropriate animal models. Mice display strong colonization resistance against the pathogen due to their host specific gut microbiota composition. To dissect the role of the commensal microbiota in colonization resistance we developed novel murine models of infection. The use of gnotobiotic mice in which the intestinal microbiota was eradicated by antibiotic treatment as well as gnotobiotic mice replenished with human or murine microbiota underlined the essential role of the murine microbiota in colonization resistance against C. jejuni. Following peroral infection, gnotobiotic mice as well as gnotobiotic mice replenished with human microbiota developed C. jejuni mediated apoptosis and inflammatory responses in the colon in situ whereas with murine microbiota associated mice cleared the pathogen within few days. The overcome of colonization could also be shown in murine models of chronic and acute inflammation. Interestingly, quantitative analysis of main gut bacterial groups of C. jejuni susceptible animals revealed 2-3 orders of magnitude higher loads of commensal E. coli in all these models. To further dissect the pivotal role of those distinct microbiota shifts in abrogating colonization resistance, we investigated C. jejuni infection in healthy adult mice in which the microbiota was artificially modified by feeding live commensal E. coli. Strikingly, in animals harbouring supra-physiological intestinal E. coli loads, colonization resistance was significantly diminished. Due to the fact that the host- specific gut microbiota establishes after weaning, we investigated colonization resistance against C. jejuni in 3-week-old mice. In infant animals infected orally immediately after weaning C. jejuni stably colonized the gastrointestinal tract for over 100 days. Within six days following infection, infant mice developed acute enterocolitis as indicated by bloody diarrhea. Similar to human campylobacteriosis disease manifestations were self-limited and disappeared within two weeks. By antibiotic treatment of C10/IL-10-/- mice right after weaning and thereby preventing these animals from development of chronic colitis due to IL-10 deficiency, we established a murine model displaying acute enterocolitis following C. jejuni infection. The severity of inflammation was indicated by bloody diarrhea and pronounced histopathological changes of the colonic mucosa. Immunopathology was further characterized by increased numbers of apoptotic cells, regulatory T-cells, T- and B-lymphocytes as well as elevated TNF-α, IFN-γ, IL-12p70, IL-22 and MCP-1 concentrations in the inflamed colon. The induction of enterocolitis was specific for C. jejuni given that control animals infected with a commensal E. coli strain did not display any signs of disease. Most strikingly, intestinal immunopathology was ameliorated in mice lacking Toll-like-receptor 4 indicating that C. jejuni-LPS is essential for induction and progression of immunopathology. These murine models mimick key features of human campylobacteriosis and allow for further analysis of immunological and molecular mechanisms of C. jejuni – host interactions.