Die Dephosphorylierung des Adapterproteins Bcl-10 durch die Ser/Thr- Phosphatase Calcineurin ist essentiell für die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in Th-Lymphozyten

Abstract

Durch Aufklärung von Signalübertragungsprozessen wird es möglich, den detaillierten molekularen Ablauf von Immunreaktionen zu rekonstruieren. Zudem bekommt man Aufschluss über Fehlfunktionen des Immunsystems was dabei hilft, therapeutische Ansätze zur Behandlung von Immunerkrankungen zu entwickeln. Für die Identifizierung und pharmakologische Intervention von gestörten Signalwegsprozessen werden häufig niedermolekulare, zellpermeable Inhibitoren benutzt. Deren Signalwegsspezifität ist ein wichtiges Kriterium für ihre Anwendung in der Forschung und Klinik. In dieser Arbeit wurden zum einen Inhibitoren des Calcineurin (CaN)/NFAT-Signalwegs hinsichtlich ihrer Kreuzreaktivität mit der T-Zell-Rezeptor-vermittelten Aktivierung der NF-κB und AP-1 Signalübertragungswege untersucht. Zum anderen wurde analysiert, an welcher Stelle des NF-κB Signalweges Calcineurin aktivierend wirkt. Für die Analyse der Kreuzreaktivität wurden die Inhibitoren AM404, BTP1, CsA, NCI3 und INCA6 untersucht. Durch Etablierung und Verwendung der „Fluorescent Cell Barcoding“-Technik konnte die Aktivierung bzw. Hemmung von NF-κB p65, p38 und ERK1/2 gleichzeitig auf Einzelzellebene bestimmt werden. Die Analysen zeigten, dass sich AM404, BTP1 und NCI3 für eine spezifische CaN/NFAT-Inhibierung eignen, während INCA6 und CsA auch die NF-κB-und AP-1-Aktivierung blockieren. Mit Hilfe des Calcineurin Inhibitors CsA konnte gezeigt werden, dass diese Ser/Thr Phosphatase an der Position des Adapterproteins Bcl-10 aktivierend auf den NF-κB Signalweg wirkt. Eine CsA Behandlung der Zellen beeinträchtigt daher die nachfolgenden Signalwegsprozesse wie IKKβ-Phosphorylierung, IκBα- Degradation, sowie Kerntranslokation und DNA-Bindung von NF-κB p65. Durch Ko- Immunopräzipitation konnte eine konstitutive Assoziation von CaN mit dem Bcl-10/MALT1-Komplex nachgewiesen werden. Diese Interaktion ist eine Voraussetzung für die Dephosphorylierung von phospho-Bcl-10 am Ser138, die bereits als eine entscheidende post-translationale Bcl-10-Modifikation für die Aktivierung von NF-κB identifiziert wurde. Die bessere Kenntnis des molekularen Mechanismus der TZR-gesteuerten NF-κB Aktivierung ermöglicht die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze, deren Target CaN und/oder Bcl-10 ist, zur gezielten Inhibierung von NF-κB-Signalprozessen bei gestörten Immunreaktionen oder Lymphomen.

The analysis of signaling processes allows the detailed reconstruction of molecular sequences of immune reactions. Thereby, it is possible to gain insight into immune-dysfunctions which will help to develop new therapeutic strategies for the treatment of autoimmune diseases. Low molecular and cell permeable inhibitors are widely used for identification and pharmacological intervention of signaling processes. Therefore, pathway specificity of inhibitors is important for clinical as well as for research applications. Here, inhibitors of the calcineurin (CaN)/NFAT-signaling pathway were analyzed with regard to their cross reactivity on T-cell-receptor mediated activation of the NF-κB and AP-1 signaling pathways. Further, it was studied at which position in the NF-κB pathway CaN exerts it´s activating function. For the analysis of cross reactivity, the inhibitors AM404, BTP1, CsA, NCI3, and INCA6 were used. Establishment of the Fluorescent cell barcoding technique allowed the simultaneous single cell measurement of activation or inhibition levels of NF-κB p65, p38, and pERK1/2. The analyses show that the inhibitors AM404 and BTP1 and NCI3 are suitable for specific inhibition of CaN/NFAT, whereas INCA6 and CsA also block the activation of NF-κB and AP-1. Using the CaN inhibitor CsA it could be shown, that the adapter protein Bcl-10 is the pathway position where this Ser/Thr phosphatase contributes to the activation of the NF-κB signaling pathway. Consequently, CsA treatment impaired downstream signaling processes like IKKβ-phosphorylation, IκBα-degradation, as well as nuclear translocation and NF-κB p65 DNA binding. By co-immunoprecipitation a constitutive association of CaN with the Bcl-10/MALT1-complex was shown. This association is a prerequisite for dephosphorylation of phosphorylated Bcl-10 Ser138, which was already identified as an important post translational modification essential for NF-κB activation. The better knowledge of the molecular processes of TCR-mediated NF-κB-activation allows the development of new therapeutic approaches which target CaN and/or Bcl-10 for the specific inhibition of NF-κB signaling processes during immune-dysfunctions or lymphomas.