Ion-channel mediated mechanotransduction in chondrocytes

Abstract

Articular cartilage is a protective tissue that covers joints with large degree of movement such as knees and elbows. Its main function is to support and distribute forces generated during body locomotion. Cartilage is comprised of individual chondrocytes that are embedded in a specialized matrix formed by collagens, proteoglycans, other non-collagenous proteins and water. Chondrocytes experience a complex mechanical environment and are able to respond to changes in mechanical loads in order to maintain cartilage homeostasis by inducing synthesis or degradation of matrix proteins. It has been proposed that mechanically-gated ion channels are of functional importance in chondrocyte mechanotransduction. Application of mechanical load in chondrocytes induce protein synthesis that is inhibited in the presence of gadolinium, a non-specific inhibitor of mechanically-gated ion channels. However, there was no direct evidence of mechanically-gated currents in these cells. Channel-mediated mechanotransduction is known as mechanoelectrical transduction, and the molecular players mediating this process remained elusive in chondrocyte biology. The aim of this thesis was to identify and characterize the mechanosensitive ion channels that are important for chondrocyte mechanoelectrical transduction. To study this, we used elastomeric pillar arrays to apply mechanical stimuli at the cell-substrate interface while clamping the membrane potential of murine chondrocytes in whole-cell configuration. We found that TRPV4 and Piezo1 channels contribute to currents produced by stimuli applied at the cell-substrate interface. In addition, only Piezo1 contributes to the stretch-activated current in chondrocytes. This is the first direct demonstration of mechanically-gated ion channel activity in primary murine chondrocytes. To study the activation mechanism of Piezo1 and TRPV4, the channels were overexpressed in HEK-293 cells. As observed before, Piezo1 is activated by membrane stretch, cellular indentation and substrate deflection. In contrast, TRPV4 was only slightly activated by membrane stretch, was not activated by cellular indentation, but was efficiently activated by substrate deflections. These results suggest that TRPV4 requires cellular components to efficiently transfer the force to gate the channel. Additionally, the data demonstrate that mechanical stimuli applied to distinct membrane compartments are transduced by separate, but overlapping transduction pathways.

Gelenkknorpel ist ein Schutzgewebe, das Gelenke mit großer Beweglichkeit bedeckt, wie z.B. Knie und Ellenbogen. Seine Hauptverteilung ist die Dämpfung und Verteilung von Kräften während der Bewegung des Körpers. Knorpel besteht aus individuellen Chondrozyten, die in eine spezielle Matrix aus Kollagenen, Proteoglykanen, anderen nicht-kollagenen Proteinen und Wasser eingebettet sind. Chondrozyten befinden sich in einer komplexen mechanischen Umgebung und können auf unterschiedliche mechanische Belastung reagieren, um ein Gleichgewicht innerhalb des Knorpels zu erhalten, indem sie die Synthese oder den Abbau von Matrixproteinen anregen. Es wird vermutet, dass mechanisch gesteuerte Ionenkanäle eine wichtige Funktion bei der Mechanotransduktion der Chondrozyten spielen. Durch mechanischen Druck auf Chondrozyten wird Proteinsynthese induziert, die durch Gadolinium, einen unspezifischen Inhibitor mechanisch gesteuerter Ionenkanäle, inhibiert wird. Allerdings gab es bisher keinen Nachweis von mechanisch gesteuerten Strömen in diesen Zellen. Durch Kanäle gesteuerte Mechanotransduktion ist als mechanoelektrische Transduktion bekannt, und bisher sind die an diesem Prozess beteiligten Moleküle in der Biologie der Chondrozyten noch unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, die mechanosensitiven Ionenkanäle zu identifizieren und zu charakterisieren, die eine wichtige Rolle bei der mechanoelektrischen Transduktion der Chondrozyten spielen. Um dies zu untersuchen, haben wir elastomere Pillar Arrays verwendet, um mechanische Reize an der Zell-Substrat- Grenze auszuüben, und dabei Gesamtzell-Ableitungen an den murinen Chondrozyten vorgenommen. Dabei haben wir herausgefunden, dass TRPV4- und Piezo1- Kanäle zu Strömen beitragen, die durch Reize an der Zell-Substrat-Grenze ausgelöst wurden. Darüber hinaus ist nur Piezo1 an dehnungsaktivierten Strömen in Chondrozyten beteiligt. Damit wurde erstmals mechanisch gesteuerte Ionenkanalaktivität in primären murinen Chondrozyten gezeigt. Um den Aktivierungsmechanismus von Piezo1 und TRPV4 zu untersuchen, wurden die Kanäle in HEK-293 Zellen überexprimiert. Wie vorher beobachtet, wird Piezo1 durch Dehnung der Membran, Eindellung der Zelle und Substratablenkung aktiviert. Im Gegensatz dazu wird TRPV4 nur leicht durch Dehnung der Membran, nicht durch Eindellung der Zelle und sehr gut durch Substratablenkung aktiviert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass TRPV4 zelluläre Komponenten benötigt, um das Signal der Krafteinwirkung zur Öffnung des Kanals weiterzugeben. Diese Daten zeigen, dass mechanische Reize, die auf bestimmte Membranabschnitte einwirken, durch unterschiedliche, sich überschneidende Transduktionswege weitergeleitet werden.