Stimuli-responsive Nanogels for Dermatology, Photothermal Therapy, and Detection of Circulating Tumor Cells

Abstract

The carfeul design and the optimization of synthetic strategies are key steps for the development of responsive nanogels (NG) that achieve the desired “smart” interaction with biological systems. In this thesis responsive nanogels were engineered through different methodologies and evaluated for their ability in biomedical applications such as for dermatology, photothermal therapy, and as capturing system for circulating tumor cells. It was found that thermoresponsive nanogels based on dendritic polyglycerol (dPG) and poly(oligoethylene glycol) (POEG) revealed an excellent biocompatible profile against human keratinocyte and fibroblast cell lines with a tolerable dose of 2 mg mL-1. The developed synthetic methodology allowed, moreover, to set the size and transition temperature of generated NGs in the range of 50 – 250 nm and 30 – 40 °C respectively. When these NGs were fluorescently labeled and applied on human skin explants a temperature dependent translocation pattern through the skin barrier and hair follicles was observed. This behavior could be attributed to the elastic nature of NGs and their structural integrity. This study demonstrated that thermoresponsive NGs reveal a great potential as smart drug carries for various hair follicle and skin related diseases. Based on the findings for the conjugation of fluorescent dyes to thermoresponsive nanogels a methodology was developed that uses ultrasound assisted precipitation polymerization. Along with the covalent incorporation of IR806, a NIR absorbing dye, into the nanogel scaffold, this methology revealed spherical shape, nanometric size (90 nm), and narrow size distribution (DLS PDI 0.16) for the generated NGs. Since IR806 is a photothermal agent that transduces NIR light into heat, NGs were evaluated for their photothermal ability against cancer cell lines. As a result selective toxicity was demonstrated when NG internalized cells were exposed to a NIR laser while excellent biocompatibility was demonstrated when cells were not exposed to a NIR laser. This study demonstrated the proof of principle that organic photothermal agents can be incorporated covalently into NGs to demonstrate reduced toxicity, improved water solubility, and excellent photothermal efficiencies. To investigate the ability of NGs for cell capturing purposes nanogels based on magnetic nanoparticles and linear polyglycerol were synthesized using strain-promoted click cross-linking chemistry. This methodology allowed moreover the surface decoration with targeting ligands. Magnetic nanogels showed cell capture efficiencies of 40 % that have to be improved in future work. Studies on the magnetic relaxations time, however, showed that the magnetic NGs obtain similar relaxivity values as commercial available contrasting agents. Hence, this study lead to the conlusion that the use of magnetic NGs is not limited to cell capturing purposes but can be extended for their use as a potential contrasting agent in MRI. This thesis shows that responsive nanogels obtain a great potential for their use in nanomedicine. Mainly their physico-chemical properties such as their size, shape, and elasticity combined with their responsiveness play a key finction on their influence to applied biological systems. Controlling these porperties can enhance the translation of responsive nanogels from bench to bedsides.

Das sorgfältige Design und die Optimierung von Synthesestrategien sind Schlüsselschritte in der Entwicklung von responsiven Nanogelsystemen, mit denen eine „smarte“ Wechselwirkung mit biologischen Systemen angestrebt werden soll. In der vorliegenden Arbeit wird die Darstellung von responsiven Nanogelen und ihre biologische Evaluation für Anwendungen in der Dermatologie, in der photothermalen Therapie, sowie für die Isolation von zirkulierenden Tumorzellen beschrieben. Mittels der freien radikalischen Fällungspolymerisation wurden die thermoresponsiven Nanogele, die auf dendritischem Polyglycerin und Poly(oligoethylenglycol) basieren, synthetisiert. Diese Synthesestrategie erlaubt das Maßschneidern der Größe der Nanogele in einem Bereich zwischen 50 – 250 nm, sowie die Kontrolle über die Phasenumwandlungstemperaturen (PUT) zwischen 30 und 40 °C. Alle synthetisierten Nanogele, unabhängig von deren Größe und PUT, weisen eine überaus hohe Biokompatibilität gegenüber menschlichen Keratinozyten und Fibroblasten in vitro auf. Farbstoff-Konjugate dieser Nanogele demonstrieren zudem eine temperaturabhängige Translokation durch die äußerste Hautschicht menschlicher Haut sowie in Haarfollikeln. Diese Eigenschaft ist hauptsächlich auf die hohe Elastizität und die strukturelle Integrität der Nanogele zurückzuführen. Diese Studie zeigt das Potential thermoresponsiver Nanogele, die für den Einsatz als smarte Wirkstoffträger für Erkrankungen von Haut und Haarwurzel genutzt werden können. Basierend auf den Erkenntnissen für die Farbstoff-Konjugation an Nanogelen wurde eine weitere Synthesestrategie entwickelt, die es erlaubt den hochsensiblen Farbstoff, IR806, in das thermoresponsive Nanogelgerüst kovalent einzubinden. IR806 ist ein im nahen Infrarot (NIR) Bereich absorbierender organischer Farbstoff der die Fähigkeit besitzt absorbiertes NIR Licht in Wärme umzuwandeln. Er zeichnet sich allerdings durch schlechte Wasserlöslichkeit, hohe Toxizität und geringe photothermale Effizienz aus. Seine erfolgreiche Einbettung in das polymere Nanogelnetzwerk hat nicht nur seine Wasserlöslichkeit verbessert und seine Toxizität um das zehnfache reduziert, sondern gleichzeitig ein dual- responsives Nanogelsystem erschaffen. Diese Nanogele, die sich durch eine Größe von 90 nm mit schmalen Größenverteilungen (Polydispersitätsindex in dynamischer Lichtstreuung: 0.16), sowie hervorragenden licht- und thermoresponsiven Eigenschaften auszeichnen, sind in der Lage, nach erfolgter Internalisierung, Krebszellen in vitro durch Aussetzung von NIR Laserbestrahlung selektiv und thermisch zu zerstören. Diese Eigenschaften gepaart mit ihrer exzellenten wasserlöslich und ihre reduzierten Toxizität erweisen sich als überaus nützlich für zukünftige in vivo Anwendungen in der photothermalen Therapie. Ferner wurde eine Synthesestrategie entwickelt, die es ermöglicht Nanogele für die Isolation zirkulierender Tumorzellen einzusetzen. Die Ultraschall-unterstützte Methode ermöglicht, in einer Kupfer- freien ‚Klick‘-Reaktion, die Quervernetzung von Bycylononyn-funktionalisierten Nanopartikeln mit azid-modifiziertem linearen Polyglycerol, und die daraus resultierende Synthese von magnetischen Nanogelen. Darüber hinaus gelingt es diesem simplen Verfahren die Nanogeloberfläche mit Targeting-Liganden zu dekorieren die dann eine spezifische Bindung zu Zellrezeptoren ausüben können. Die magnetischen Nanogele zeigen eine 30 prozentige Zellerfassungseffizienz, die anhängig von der Länge des eingesetzten polymeren Abstandhalters zwischen Targeting-Ligand und Nanogel ist. Des Weiteren zeigen magnetische Relaxationsstudien, dass magnetische Nanogele eine ähnliche Relaxivität wie kommerziell erhältliche Kontrastmittel in der MRT aufweisen. Diese Erkenntnis führt zu dem Schluss, dass der Einsatz magnetischer Nanogele nicht auf Zellerfassungsuntersuchungen begrenzt ist, sondern das Potential besitzt Anwendung in der MRT zu finden. Diese vorgelegte Arbeit verdeutlicht das große Potenzial von responsiven Nanogelen für biomedizinische Anwendungen. Es sind hauptsächlich die physikalisch-chemischen Eigenschaften wie ihre Größe, Form, und Elastizität die Schlüsselfunktionen in der Interaktion mit biologischen Systemen ausüben. Eine effiziente synthetische Kontrolle über diese Eigenschaften kombiniert mit ausführlichen biologischen Evaluationen kann ihre klinische Translation vom Labor zum Patienten ermöglichen.