Structure-function relationship of von Willebrand factor: Collagen-binding and platelet adhesion at physiological shear rate conditions using an in vitro flow-chamber model

Abstract

The von Willebrand factor (VWF) is the critical determinant of thrombus formation in flowing blood. The multimeric glycoprotein present in human plasma as a series of multimers, containing a variable number of subunits with sizes of 500 to >10,000 kDa, is required for platelet recruitment to injured vessel walls at physiological high arterial shear rates. Binding of VWF to exposed structures of the subendothelium results in platelet tethering, activation and finally adhesion. Furthermore, VWF functions as a carrier for coagulation factor VIII (FVIII) protecting it from rapid proteolytic inactivation. VWF deficiency results in the most common inherited bleeding disorder, the von Willebrand disease (VWD). VWD patients suffer from mild to severe bleeding, and – depending on the severity of haemorrhages – require normalisation of plasma VWF and FVIII levels via VWF/FVIII concentrates. Currently, VWF activity assays are performed under static or low shear rate conditions, albeit in vivo VWF exhibits its function primarily above a critical shear rate of >1,000 per second. The presented work describes the establishment of an in vitro flow-chamber system to investigate VWF-mediated platelet adhesion under defined shear rate conditions present in circulation. The device is extensively characterised with respect to coating, choice of collagen, VWF-collagen binding and exposition of binding domains responsible for platelet interaction, as well as mediation of platelet recruitment under flow, whereas the established model allows the investigation of platelet adhesion solely depending on the presence of VWF. Results suggest the contribution of all VWF multimers to platelet adhesion on collagen due to binding of low- as well as high molecular weight VWF multimers at all shear rates investigated. Platelet binding domains co-localised to the VWF molecule were exposed to a similar extent. Implementation of the flow-chamber model to compare five commercially available VWF-containing concentrates showed effective platelet recruitment for all concen¬trates tested, but revealed significant differences in the degree of platelet adhesion, which did not correlate with the VWF multimer distribution of the applied sample. Fractionation of VWF into different sized multimers and investigation of collagen-binding kinetics using surface plasmon resonance as well as their ability to mediate platelet adhesion under flow revealed a dimished capability for multimers below four, but a comparable activity of intermediate- and high molecular weight multimers. In conclusion, the established flow-chamber system provides a promising tool for the investigation of VWF function under defined shear rate conditions. Subsequent studies investigating the impact of VWF triplet structure as well as the implementation of the system to study VWD variants will show the contribution of the developed flow device to a possible use in classification of VWD and quality control of VWF-containing concentrates.

Der von Willebrand-Faktor (vWF) ist ein Plasmaglykoprotein, das essentiell an der Blutgerinnung beteiligt ist, und im Blutplasma in globulärer Konformation aus unterschied¬lich großen Multimeren mit Molekulargewichten zwischen 500 und >10.000 kDa zirkuliert. Neben der Initiation der primären Hämostase bei arteriellen Scherraten durch Bindung an exponierte Strukturen des Gefäßendothels, schützt er den Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) durch Komplexbildung vor Inaktivierung und Abbau. Liegt eine Gefäßverletzung vor, bindet der vWF an subendotheliale Matrixproteine, wodurch die Affinität zwischen Thrombozyten und vWF induziert wird. Dies führt über die Bindung an Oberflächenrezeptoren der Thrombozyten zur Plättchenadhäsion. Mangel an vWF bzw. eine fehlerhafte Synthese des Proteins verursachen die häufigste erblichen Blutungskrankheit, das von Willebrand-Syndrom (vWS). Schwere Formen der Krankheit müssen durch Substitutionstherapie mit VWF/FVIII- Kombinationspräparaten behandelt werden. Derzeit wird die Aktivität des vWFs durch Tests unter statischen Bedingungen bzw. bei sehr geringen Scherraten bestimmt, wobei die Funktionsfähigkeit des vWFs in vivo erst bei Scherraten >1.000 pro Sekunde essenziell ist. Um die vWF-vermittelte Thrombozytenadhäsion unter definierten Strömungsbedingungen zu untersuchen, wurde ein in vitro Flusskammersystem entwickelt. Eine ausführliche Charakterisierung erfolgte im Hinblick auf Beschichtung, Wahl des Kollagens, vWF-Kollagen-Bindung und Verfügbarkeit der für die Rezeptorbindung zu Thrombozyten verantwortlichen Bindungsdomänen. Das etablierte Modell ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenadhäsion ausschließlich in Abhängigkeit des vWFs, wobei der zeitliche Verlauf direkt unter dem Mikroskop verfolgt werden kann. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass alle vWF-Multimere an der Vermittlung der Thrombozytenadhäsion beteiligt sind. Der Einsatz des entwickelten Flusskamermodells für den Vergleich von fünf VWF/FVIII-Präparaten zeigte für alle Produkte eine effektive Thrombozytenadhäsion bei hohen Scherraten, wobei der Grad der Adhäsion stark variierte. Die beobachteten Unterschiede korrellierten dabei allerdings nicht mit der vWF-Multimerenverteilung der Präparate. Eine Trennung in Fraktionen mit unterschiedlich großen Multimeren zeigte, dass vWF-Fraktionen mit Multimeren kleiner vier im Vergleich zu Franktionen, die mittlere und hohe vWF-Multimere enthielten, eine verminderte Kollagen-Bindung in der Oberflächenplasmonresonanz sowie eine geringere Thrombozytenadhäsion unter hohen Flussraten aufwiesen. Das etablierte Flusskammermodell stellt ein viel versprechendes Instrument zur Analyse der vWF-Funktion unter definierten Scherraten dar. Weiterführende Untersuchungen zum Einfluss der vWF-Triplettstruktur auf die Funktion des Proteins sowie der Einsatz für Studien an vWS-Subtypen werden zeigen, ob das entwickelte System einen Beitrag zur vWS-Diagnostik und Qualitätskontrolle von vWF/FVIII- Präparaten leisten kann.