Etablierung eines in vivo Mausmodells zur Bewertung der Rolle des Nebenhistokompatibilitätsantigens H13 bei der Induktion eines “Graft-versus- Leukemia” Effekts mittels in vivo Biolumineszenz-Imaging

Abstract

Die allogene Knochenmarktransplantation, eine Therapiemodalität für maligne Krankheiten des hämatopoetischen Systems, hat auch bei vollständiger Übereinstimmung innerhalb des MHCs den Nachteil einer Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), verursacht durch Nebenhistokompatibilitätsantigene (mHAgs), zusätzlicher Transplantationsantigene, die außerhalb des MHCs existieren.Durch die Identifizierung nur hämatopoetisch exprimierter mHAgs, und durch die Stimulation der Spenderlymphozyten, die anschließend an einer KMT als Therapie angewandt werden (Spenderlymphozyteninfusion) mit den von Transkriptionsprodukten solcher mHAgs prozessierten Peptiden, könnte jedoch ein GvL (Graft versus Leukemia )–Effekt ohne GvHD erreicht werden. Um das zu überprüfen, wurde ein Maus-Modell entwickelt, wobei sich zwei im MHC identische Mäusestämme (C.B10 und B 6) in 5 mHAgs voneinander unterscheiden. Das ausgewählte H 13 mHAg ist beim C.B10 Stamm (Spender) als H 13b-Haplotyp bzw. beim B6-Stamm (Empfänger) als Haplotyp H13a vorhanden. Die von diesen zwei Haplotypen prozessierten Peptide, SIL 9 beim Spenderstamm und SVL 9 beim Empfänger, zeigen aufgrund der Substitution einer Methyl-Gruppe die Differenz auf einer Aminosäureposition (Isoleucin statt Valin) und werden beide durch die MHC-Klasse I Db–Moleküle präsentiert. Empfängertiere wurden subletal bestrahlt und i.v. mit den hämatopoetischen Zellen des Spender in einer Mischung mit vom B6–Stamm-abgeleiteten Leukämiezellen, EL 4, bzw. mit ihrer mit Ovalbumin-transfizierte Variante EG 7 injiziert. Die Tumorpräsenz und Dynamik seines Wachstums wurden wöchentlich mittels der Biolumineszenz-Imaging Methode untersucht, und die Therapie nach einem der zwei Grundprinzipien angesetzt: entweder wurde Spender in vivo durch die B6-Milzzellen und SVL 9 Peptid immunisiert und mit SVL 9 Peptid anschließend in vitro restimuliert, oder die Spenderlymphozyten wurden nur einmal, in vitro mit SVL 9 stimuliert.Beide therapeutischen Optionen wurden bei den aufgrund der Größe des Tumors standardisierten Mäusegruppen angewandt, und die Anwesenheit der restlichen Tumorzellen nach der Behandlung mittels ß-Galaktosidase–Nachweis (Gal-X) untersucht. Die Behandlung mit der immunisierten Spenderlymphozyteninfusion führte bei beiden therapeutischen Varianten zu einem längeren Überlebens (mehr als die Hälfte der Mäuse überlebte länger als 80 Tagen), im Vergleich mit der Behandlung mit nicht immunisierter Spenderlymphozyteninfusion (39-70 Tagen), bzw. mit der Kontrollgruppe (22.-34. Tagen). Bei den therapieresistenten Mäusen wurden die regulatorischen CD4+/CD25+ -und CD4+/Foxp3 T-Lymphozyten untersucht, und bei den länger als 80 Tagen überlebenden Mäusen die Anwesenheit die SVL 9–spezifischer CD 8+–T-Lymphozyten mittels CFSE- in vivo Zytotoxizitätstest.

The allogenic bone mark transplantation, a treatment modality for malignant diseases of the hematopoietic system, has the disadvantage of a Graft-versus- Host disease (GvHD), even under a complete congruency within the MHCs, caused by minor histocompatibility antigens (mHAgs), additional transplantation antigens, existing outside the MHCs. However, by the identification of only hematopoietically expressed mHAgs and by the stimulation of donor lymphocytes which are applied as a therapy on a KMT (donor lymphocyte infusion) with peptides processed of transcription products of such mHAgs a GvL (Graft versus Leukaemia) effect without GvHD could be reached. In order to test that a mouse model was developed where two mouse strains (C.B10 und B 6) identical in MHC distinguish from each other in 5 mHAgs. The select H 13 mHAg exists in the C.B10 strain (donor) as H 13b-Haplotype or at the B6 strain (recipient) as haplotype H13a. The peptides processed of these two haplotypes, SIL 9 at the donor strain and SVL 9 at the recipient, show the difference on an amino acid position (isoleucine instead of valine) due to the substitution of a methyl group and they are both represented by MHC-class I Db–molecules. Recipients were sublethally irradiated and i.v. with the hematopoietic cells of the donor injected in a mixture of B6-strain-derived leukaemia cells, EL 4, or its ovalbumin-transfected variant EG 7. The tumour presence and the dynamics of its growth were weekly examined by the bioluminescence-imaging method and the treatment was started according to one of the two basic principles: either the donor was immunised in vivo by the B6 splenetic cells and SVL 9 Peptide and afterwards restimulated in vitro, or the donor lymphocytes were stimulated only once in vitro with SVL 9. Both therapeutic options were applied to the mouse groups standardized due to the size of the tumour and the presence of the remaining tumour cells were examined by the ß-galactosidase test (Gal-X) after the treatment. In both therapeutic options the treatment with the immunised donor lymphocyte infusion resulted in a longer survival (more than half of the mice survived more than 80 days), compared to the treatment with a non-immunised donor lymphocyte infusion (39-70 days) or to the control group (22 – 34 days). In mice difficult to treat the regulatory CD4+/CD25+- and CD4+/Foxp3 T-lymphocytes were examined and in mice who survived more than 80 days the presence of SVL 9–specific CD 8+–T-lymphocytes was examined by CFSE- in vivo cytotoxicity tests.